¿Qué hace que sea difícil para una proteína eucariótica ser sintetizada por bacterias?

Las células procariotas (bacterias, especialmente E. coli ) son normalmente el huésped preferido para la expresión de proteínas extrañas porque ofrecen:

  1. Necesidades económicas de fuente de carbono para el crecimiento,
  2. Rápida acumulación de biomasa
  3. Amenabilidad a la fermentación de alta densidad celular, y
  4. Ampliación simple del proceso.

Sin embargo, la falta de maquinaria postraduccional y la producción de proteína inactiva debido a la formación de cuerpos de inclusión, ofrecen un desafío significativo en esta expresión.

Una desventaja de usar un organismo como E. coli para la expresión de proteína eucariótica es que es un procariota y, por lo tanto, carece del núcleo unido a la membrana (y otros orgánulos) que se encuentran en células eucarióticas. Esto significa que ciertos genes eucariotas pueden no funcionar en E. coli como lo harían en su entorno normal, lo que puede obstaculizar su aislamiento mediante mecanismos de selección que dependen de la expresión génica. Además, si la producción de proteína eucariota es el resultado deseado de un experimento de clonación, no es fácil garantizar que el huésped procariota produzca una proteína completamente funcional.

Para comprender las dificultades en la expresión de una proteína eucariota en un huésped procariota (es decir, bacterias), se deben considerar los siguientes factores:

  1. Preferencia de codones o preferencia de codones : algunas especies usan codones particulares con mayor frecuencia que otras, exhibiendo preferencia de codones o sesgo de codones. La mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un codón y todos los codones de aminoácidos disponibles se utilizan según el sesgo / preferencia del codón de cada organismo. El ARN de transferencia (ARNt) de las células refleja el sesgo del codón de su ARNm. Cualquier gen heterólogo con abundantes codones, que rara vez se usan en bacterias, puede no expresarse adecuadamente en bacterias y puede dar lugar a errores de traducción.
  2. Plegamiento de proteínas: la proteína eucariota expresada en las células bacterianas se dirige a tres lugares diferentes: el citoplasma, el periplasma y en el medio de crecimiento a través de la secreción. Pero muchas veces ocurre la formación de disulfuro no nativa que conduce a la formación de agregados insolubles y mal plegamiento.
  3. Fosforilación y glucosilación de proteínas: las bacterias tienen una función de maquinaria eucariota postraduccional limitada, que se considera una desventaja clave para producir las fosfoproteínas eucariotas, es decir, las serina / treonina / tirosina proteína quinasas.

    La glucosilación es otra modificación importante posterior a la traducción. Es responsable de la formación de glicanos celulares que a menudo se unen a proteínas y lípidos. La glicosiltransferasa y las glucosidasas son enzimas responsables de la glucosilación de muchas proteínas. Las glicoproteínas, que se distribuyen comúnmente en células eucariotas, rara vez se presentan en organismos procariotas porque los orgánulos celulares esenciales para la glicosilación están ausentes en estos organismos.

  4. Estabilidad del ARNm: los genes de diferentes organismos tienden a tener diferentes contenidos de G + C, con genes bacterianos que tienen un contenido de G + C particularmente bajo. Un alto contenido de A + T en el ADN bacteriano a menudo da como resultado la presencia de secuencias (AUUUA) que pueden desestabilizar el ARNm.

Referencias

  1. Adrian Slater, Nigel W. Scott y Mark R. Fowler, Biotecnología Vegetal, manipulación genética de plantas, segunda edición.
  2. Sudhir Sahdev, Sunil K. Khattar, Kulvinder Singh Saini, Producción de proteínas eucariotas activas a través de sistemas de expresión bacterianos: una revisión de las estrategias de biotecnología existentes, Mol Cell Biochem (2008) 307: 249-264, DOI 10.1007 / s11010-007-9603 -6
  3. Khow, Orawan y Sunutcha Suntrarachun. “Estrategias para la producción de proteínas eucarióticas activas en el sistema de expresión bacteriana”. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2.2 (2012): 159-162. PMC . Web. 22 de diciembre de 2014.
  4. Desmond ST Nicholl, una introducción a la ingeniería genética. Segunda edicion.

Hay una serie de problemas, algunos más fáciles de resolver que otros.

1- promotor diferente; no es difícil de resolver, ya que podemos empalmar en un promotor nativo (a las bacterias). Incluso podemos hacerlo inducible, por lo que se expresa cuando queremos

2 bacterias carecen de intrones. Es muy probable que un gen de eucariotas (como la expresión de proteínas humanas) contenga secuencias no traducidas llamadas intrones. Los eucariotas normalmente los empalman. Algunos se auto empalman, pero otros requieren una modificación postranscripcional en el núcleo. Este problema no es tan malo, ya que podemos tomar ARNm del citoplasma de células eucarióticas y luego transcriptasa inversa para hacer una copia de ADN (ADNc). Esto puede amplificarse mediante pcr y clonarse en un plásmido.
3- modificación postraduccional. Muchas proteínas eucariotas se modifican después de la traducción. Se pueden agregar grupos de azúcar (glicosilación), o grupos de lípidos, se pueden agregar, eliminar o modificar aminoácidos. Se pueden formar enlaces disulfuro (mucho más fácil en el retículo endoplásmico que el citoplasma, aunque las bacterias sí tienen enzimas para hacerlo).
Esto se logra comúnmente a través de la vía secretora en eucariotas. Sin embargo, las bacterias carecen de los orgánulos, y solo “saben” cómo hacer algunas modificaciones. Además, las señales de secuencia indican qué modificaciones realizar podrían no reconocerse.
Este problema podría resolverse mejor simplemente expresando la proteína darn en eucariotas como levadura o una planta.

Daniel Spector