La forma más fácil de evaluar la fosforilación de proteínas es realizar un ensayo de quinasas in vitro . Esto es muy sencillo de configurar:
- Purifique su quinasa y / o sustrato de su sistema de elección.
- Mézclalos juntos en un buffer apropiado y agrega ATP etiquetado con 32P. Incubar por un tiempo
- Ejecútelos en un gel y compruebe las bandas de radioactividad.
Obtienes mucha información útil usando este método simplemente observando las bandas, como un número aproximado de sitios de fosforilación o el grado de fosforilación en el sustrato. Esta es también una buena manera de juzgar la actividad de diferentes mutantes de quinasa en diferentes condiciones. Y, por supuesto, en última instancia, puede identificar la frecuencia de los sitios de fosforilación mediante la escisión de bandas específicas del gel de proteínas y la realización de MS.
Si desea resultados cuantitativos más precisos, existen varios kits disponibles en el mercado que miden la cantidad de ADP generada en la reacción de quinasa mediante el uso de algún tipo de sistema emisor de fluorescencia (como los que están disponibles aquí). Estos sistemas también se pueden ampliar para identificar / estudiar pares de quinasa-sustrato específicos mediante el uso de microarrays de proteínas.
La fosforilación global de proteínas puede cuantificarse purificando el proteoma celular y enriqueciendo los péptidos digeridos para fosfopéptidos usando cromatografía de intercambio de cationes fuertes, seguida de MS. Los fosfoproteomas de diferentes tipos de células o en diferentes fases del ciclo celular se pueden comparar mediante el uso de una combinación de SILAC y MS.