Un gel sería bueno. Después de todo, puedes determinar el tamaño de la proteína X. ¿Quieres obtener un poco más de información? Trypsinize X para ver si hay algún fragmento. Un gel nativo no reductor también puede decirle si X forma un dímero o un solo monómero. Geles 2D también le dará información sobre el pI de X.
Sin embargo, eso sería aburrido. Permite obtener información rica. MS / MS sería lo primero absoluto que correría. De inmediato, podrá determinar la secuencia peptídica, las principales modificaciones postraduccionales, la formación de enlaces disulfuro, así como el peso molecular.
Suponiendo que tuvo éxito en la determinación de la secuencia peptídica de X. ¿Qué es X? BLAST proporcionaría algunas pistas. Las alineaciones le permitirán hacer inferencias en estructura y función. Pero digamos que somos (no) afortunados y encontramos una proteína nueva. Vamos a llamarlo proteína X purificada desconocida.
Vamos a ver a qué se une esta misteriosa X? Una matriz de proteínas sería un buen comienzo. Eso podrá encontrar varias interacciones proteína-proteína. Si tiene un anticuerpo anti-X, podría expresar la proteína en una célula y Co-IP cualquier complejo de proteína. Un experimento ChIP te dará una idea de a qué se une el ADN X. La información sobre los socios de interacción lo ayudará a determinar el rol funcional de X al agruparlo con proteínas similares.
Ahora hemos descubierto que X se une a algunas proteínas conocidas conocidas como Y. Ahora nos gustaría determinar qué tan fuertemente se une X a Y. Hay unas pocas docenas de ensayos de unión de ligandos que uno puede ejecutar. Si tenemos prisa, podemos seguir con EMSA o ensayos de unión competitiva usando proteínas radiomarcadas. ITC si eres hardcore Sin embargo, dado que somos fanáticos, vamos con el biacore y el SPR a través de las interacciones proteína-proteína.
Ahora que conocemos las diversas interacciones y funciones potenciales de la proteína, nos gustaría determinar dónde están los residuos de la función clave. Hacer proteínas truncadas y probar las interacciones proteína-ligando reducirá las regiones de interés. Una vez que tenga una buena comprensión de las regiones importantes de X, una exploración de alanina o una mutagénesis de saturación proporcionará una comprensión bioquímica y funcional de los residuos clave en la interacción XY.
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Como realmente queremos saber todo lo que hay sobre esta proteína, ahora sería el momento de determinar la estructura. Reserve un medio año para cristalizar la proteína, haga algunos co-cristales y hágalos disparar en la viga. Si la proteína es más pequeña y tiene una NMR de 700 hz, determine la estructura de la solución. De lo contrario, cyro-EM o SAXS proporcionará una estructura globular de baja resolución de la proteína.
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