Dios mío, qué excelente pregunta. Tuve mucha suerte de encontrar esta reseña que contiene una historia muy detallada de todo el descubrimiento del mecanismo y el proceso. Es una muy buena lectura y la historia es increíblemente fascinante. Estructura de la tapa 5′-terminal en el messen eucaryotic … [Microbiol Rev. 1980] [1]
El descubrimiento original de la cápsula 5 ‘fue realizado por Ramachandra Reddy y Harris Busch en 1974, mientras examinaban la estructura de los ARN nucleares pequeños (snRNA) de las células de hepatoma de Novikoff. [2]
Me parece interesante que descubrieron un componente esencial del ARNm mientras miraban ARNsn. La hipótesis era que el snRNA U1 se traficaba a diferentes áreas de la célula debido a alguna característica estructural. A través de una serie de digestiones, se dieron cuenta de que el extremo 5 ‘era inusualmente grande. Los siguientes fueron varios experimentos bioquímicos para separar fragmentos de ARN marcados en geles 2D para secuenciar el ARN (esta es la secuenciación de ARN de la vieja escuela). En el extremo 5, identificaron la 2,2,7-trimetilguanosina y la 2’-O-metil adenosina. En ese momento, su hipótesis era que el límite 5 ‘estaba involucrado con la formación del complejo RNP. [2]
Se observó la presencia de un nuevo casquete novedoso ya que los extremos 5 ‘de los ARNm eucariotas eran resistentes a la degradación en comparación con los ARNm procariotas. Perry y Kelly identificaron una gran presencia de metilación alrededor del extremo 5 ‘particularmente N6-Metilo A [3]. Casi al mismo tiempo que el descubrimiento de un límite 5 ‘, varios grupos que observaron virus de ARN identificaron varias metiltransferasas implicadas en la metilación del ARN viral. Esto junto con la comprensión de que la presencia de AdoMet era necesaria para la transcripción sugirió que el límite tiene un papel funcional importante.
La elucidación de la estructura de la tapa aprovechó la resistencia de la tapa a la fosfatasa alcalina. Yasuhiro Furuichi y Aaron Shatkin comenzaron a observar el límite durante el ciclo de vida de los reovirus. El ARNm se sintetizó con AdoMet y se etiquetó 32P para generar el límite. En orden, los pasos para aislar y degradar el límite fueron [4]
- Nuclease P1 para aislar la cápsula 7mGpp * pGm.
- Nucleótido pirofosfatasa para romper la tapa en 7mGp + pGm + P *
- Fosfatasa alcalina para romper los componentes en 7mG + Gm + P *
La formación de pG en el paso dos indicó la presencia del enlace 5′-5 ‘[1]
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Con la estructura resuelta y la presencia confirmada, la siguiente pregunta fue cuál era el punto del límite 5 ‘y cómo se formó. Era evidente que la estructura estaba en todos los ARNm en eucariotas, varios virus, así como varios ARN nucleares. El descubrimiento de los límites conduce a una búsqueda masiva de las estructuras cap otros otros RNA funcionales. Durante esa búsqueda, se descubrió que muchos de los ARN con sentido negativo de virus no tenían tales límites. La mayoría de las primeras bases tendían a ser purinas.
La demostración del papel de la estructura cap en la traducción del ARNm fue realizada por Both y Shatkin utilizando la síntesis de proteínas in-vitro. La falta de metilación y el límite resultó en una reducción drástica de la eficacia de la traducción que respalda el papel estructural del límite. [5] Experimentos adicionales indicaron que el casquete 5 ‘interactuó con las subunidades ribosómicas 40S. La actividad de traducción para los ARNm procariotas podría obtenerse tratando los ARNm con las enzimas de terminación relevantes. Finalmente, la presencia del límite resultó en semividas significativamente más largas para los ARNm modificados. [1]
Tras el examen de la estructura, era evidente que varias enzimas eran necesarias para la formación de la tapa. Bernard Moss y sus estudiantes utilizaron los viriones vaccinia para purificar la guanililtransferasa, la (G-7-) metiltransferasa y la 2′-O-Metiltransferasa. Se descubrió que estas proteínas limitantes tenían una afinidad hacia los homopolirribonucleótidos, lo que hacía que la purificación fuera bastante sencilla. Una vez que se identificaron las enzimas virales, fue relativamente sencillo purificar los equivalentes eucariotas. [6]
En resumen, el descubrimiento del límite 5 ‘vino de buscar diferencias estructurales entre varios ARN con funciones nuevas. A partir de la identificación y determinación estructural de un novedoso límite, la búsqueda de la presencia del límite en otros ARN sugirió un papel para el límite en la traducción. El conocimiento estructural de la tapa y las pistas sobre el mecanismo de formación de la tapa permitieron la purificación de las enzimas involucradas en el proceso.
[1] Estructura de la tapa 5′-terminal en el mensaje eucariótico … [Microbiol Rev. 1980]
[2] Secuencia primaria de ácido ribonucleico nuclear U-1 … [J Biol Chem. 1974]
[3] Los constituyentes metilados del ARN mensajero de células L: ev … [Cell. 1975], constituyentes metilados de ARN nuclear heterogéneo: p … [Cell. 1975]
[4] El ARN mensajero del reovirus contiene una m … [Proc Natl Acad Sci US A. 1975]
[5] Traducción dependiente de metilación o … [Proc Natl Acad Sci US A. 1975]
[6] ARNm (nucleósido-2 ‘-) – metiltransferasa del virus vaccinia. Características y especificidad del sustrato., ARNm guanililtransferasa y ARNm (guanina-7 -) – m … [J Biol Chem. 1976]
