Está la manera “fácil” y la “difícil”. En cualquier caso, debes comenzar por reventar la celda abierta. Hay detergentes que hacen esto o puedes sonicar para romper las celdas con ondas de sonido. Ambos funcionan, depende de lo que estés tratando de aislar y de cuánto tienes y cuál es mejor.
La manera fácil es hacer inmunoprecipitación. Aquí es donde tienes un anticuerpo específico para tu proteína de interés, en tu ejemplo de ARN polimerasa, y lo agregas al lisado celular. En la imagen de abajo lo están sacando de la solución al agregar un complejo que lo hace insoluble, lo he hecho donde el anticuerpo está unido a un cordón. De cualquier manera, centrifugue, elimine la fracción líquida y conserve un sedimento. Existen amortiguadores que pueden forzar al anticuerpo a liberar su proteína de interés, momento en el que se centrifuga nuevamente y se mantiene la fracción líquida, que contiene su proteína.
(de Leinco Technologies, excelencia en investigación temprana de descubrimiento)
Hay algunos problemas con este método. Una es que realmente depende de tener un gran anticuerpo, que es raro. Otra es que es probable que traigas otras proteínas en tu preparación. Las proteínas a menudo se asociarán entre sí para formar complejos y todos los miembros del complejo estarán en su solución final. Esto puede ser útil, si desea identificar qué se une a su proteína de interés. Pero si quieres que sea puro, es un problema.
La manera “dura” es a través de columnas y cromatografía. En este caso, tienes una resina en la columna y las proteínas pasan a través de ella. Dependiendo de las propiedades fisicoquímicas de la resina, diferentes proteínas interactuarán con el material durante diferentes períodos de tiempo y esto hará que viajen a través de la columna a diferentes velocidades. Las variantes comunes son cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de iones que se separan por masa y carga, respectivamente. En general, debe ejecutar su lisado a través de múltiples columnas para purificarlo por completo.
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(de Cromatografía de columna – Danielle Hinckley)
También es completamente razonable comenzar con la inmunoprecipitación y luego separar el puñado de proteínas que aisló con una columna o comenzar con una columna y luego extraer su proteína con un anticuerpo. Simplemente depende de lo que planeas hacer con la proteína para lo que funciona mejor.
