¿Puedo separar los agregados de proteína de la proteína soluble y probarlos con SDS PAGE?

Desea utilizar PAGE nativa, cromatografía de exclusión de tamaño o electroforesis capilar para la segunda parte de este experimento. Si la agregación es reversible, puede que necesite reticular químicamente los agregados para evitar que se disocien durante su análisis.

En mi experiencia, 10000RCF no es suficiente para eliminar todos los agregados de la solución. Si desea separar los agregados rápida y simplemente, sugiero usar una membrana de diálisis o una unidad de filtración centrífuga con un MWCO 2-3x por encima de su monómero.

Obtenga unidades de filtración centrífuga con MWCO de 2x a 10x de su monómero MW. Ejecútelos según las instrucciones del fabricante. Tome el filtrado y retenido y ejecute PÁGINA nativa para ver qué unidad de filtro le proporciona la mejor separación de su monómero de los agregados.

No. SDS-PAGE es desnaturalizante (SDS es un detergente) y desplegará todas las proteínas, interrumpiendo así cualquier tipo de interacciones cuaternarias proteína-proteína.

Habiendo dicho eso. Native PAGE preservará las interacciones. Pero la mejor manera de observar esto sería utilizando algún tipo de columna analítica de filtración en gel (como las columnas de exclusión de tamaño S200 y S75). Puede ejecutar una mezcla estándar de proteínas de peso molecular conocido y determinar el peso molecular exacto de sus agregados de orden superior. Esto también ayudará a purificar su proteína no agregada de esas cosas molestas.