¿Cómo puede la proteína CRISPR Cas ‘elegir’ a qué cromosoma unirse?

Esto se aclarará con el tiempo, pero el fantástico trabajo de mi amigo Sam Sternberg en Nature muestra que Cas9 se une a sitios PAM en todo el genoma de manera inespecífica e interroga sobre la complementariedad de la secuencia guía después de 1) enlazar el PAM y 2) abrir el ADN. Si la secuencia guía “se ajusta”, por así decirlo, Cas9 luego corta el ADN. Este es un mecanismo de búsqueda bioquímica muy interesante con muchas implicaciones para la ingeniería del genoma (es decir, si está utilizando un Cas9 catalíticamente inactivo fusionado con algún efector de proteína, en otras palabras, los objetivos fuera de control “vinculante” y “escisión” están relacionados pero son distintos)

Cas9 puede escindir promotores fuertemente metilados en líneas celulares humanas (ver mi artículo el año pasado en Nature Biotech sobre perfiles de especificidad de Cas9), aunque estudios recientes de ChIP (ver el documento Nature Biotech de Xuebing Wu del laboratorio de Phil Sharp) muestran una fuerte asociación con eucromatina. Curiosamente, no vemos una fuerte correlación entre la eficiencia indel y la hipersensibilidad a DNasa.

¡solo tenga en cuenta que el campo se está moviendo rápidamente, por lo que esta respuesta estará desactualizada pronto!

Cas9 no elige el cromosoma de interés. Se guía con sgRNA (incluido el andamio). En lugar de las versiones recién diseñadas (por ejemplo, hfCas9), cas9 puede tolerar hasta 5 nt de discordancias que producirán efectos fuera del objetivo (es decir, dsb en diferentes cromosomas).