Como ha usado “molécula” en lugar de “proteína”, supongo que está preguntando sobre la medición de afinidades para moléculas pequeñas no proteicas. (Si está interesado en medir las afinidades proteína-ADN, los cambios de gel con ADN marcado y proteína purificada probablemente sea la mejor manera de hacerlo).
Probablemente el mejor método para hacerlo es la calorimetría de titulación isotérmica. Esencialmente, comienzas con una concentración muy alta de tu ADN y tu ligando de interés (alto micromolar a milimolar de cada uno) y titula pequeños volúmenes de ligando concentrado en el ADN. Después de cada pequeña inyección, se mide la cantidad de calor que se debe agregar o restar a la muestra para que vuelva a la temperatura de referencia. Esto funciona debido a los pequeños pero medibles cambios en entalpía y entropía asociados con interacciones no covalentes.
Los datos que obtiene de esto normalmente se parecen al ejemplo a continuación. El panel superior muestra los datos brutos (cada pico hacia abajo representa la corrección de temperatura que tiene lugar cuando se agrega un poco de ligando), y el fondo es la integración de la energía añadida en función de la relación molar de ligando a (en este caso) proteína. Esencialmente, una vez que haya saturado todos los sitios de unión para su ligando, la adición de ligando extra tiene un efecto insignificante en el sistema.
La afinidad y la estequiometría pueden determinarse estableciendo la relación molar de ligando a proteína en la que ha tenido lugar la mitad del cambio total de entalpía. La estequiometría es simplemente la relación en sí, mientras que la afinidad se calcula a partir de la concentración de ligando y ADN presente a la mitad del cambio de entalpía.
Esta técnica requiere grandes cantidades de material y algunos equipos muy precisos, por lo que generalmente no es una primera opción para este tipo de mediciones cuando hay algo más disponible. Sin embargo, ¡brinda datos realmente geniales!