¿Cómo se mide la afinidad de una molécula para unir ADN?

Como ha usado “molécula” en lugar de “proteína”, supongo que está preguntando sobre la medición de afinidades para moléculas pequeñas no proteicas. (Si está interesado en medir las afinidades proteína-ADN, los cambios de gel con ADN marcado y proteína purificada probablemente sea la mejor manera de hacerlo).

Probablemente el mejor método para hacerlo es la calorimetría de titulación isotérmica. Esencialmente, comienzas con una concentración muy alta de tu ADN y tu ligando de interés (alto micromolar a milimolar de cada uno) y titula pequeños volúmenes de ligando concentrado en el ADN. Después de cada pequeña inyección, se mide la cantidad de calor que se debe agregar o restar a la muestra para que vuelva a la temperatura de referencia. Esto funciona debido a los pequeños pero medibles cambios en entalpía y entropía asociados con interacciones no covalentes.

Los datos que obtiene de esto normalmente se parecen al ejemplo a continuación. El panel superior muestra los datos brutos (cada pico hacia abajo representa la corrección de temperatura que tiene lugar cuando se agrega un poco de ligando), y el fondo es la integración de la energía añadida en función de la relación molar de ligando a (en este caso) proteína. Esencialmente, una vez que haya saturado todos los sitios de unión para su ligando, la adición de ligando extra tiene un efecto insignificante en el sistema.


La afinidad y la estequiometría pueden determinarse estableciendo la relación molar de ligando a proteína en la que ha tenido lugar la mitad del cambio total de entalpía. La estequiometría es simplemente la relación en sí, mientras que la afinidad se calcula a partir de la concentración de ligando y ADN presente a la mitad del cambio de entalpía.

Esta técnica requiere grandes cantidades de material y algunos equipos muy precisos, por lo que generalmente no es una primera opción para este tipo de mediciones cuando hay algo más disponible. Sin embargo, ¡brinda datos realmente geniales!

El método más preciso para medir la afinidad de unión molécula-ADN podría ser ITC como dijo el Usuario de Quora. Por ejemplo:


(Datos de ITC para la unión de Klenow a oligómeros de ADN cortos. De: Biophysical Journal 2006 Volume 90 1739-1751)

Vince J. LiCata ha realizado algunos trabajos hermosos para analizar termodinámicamente las interacciones moleculares. Otro método para medir la afinidad de unión presentado en este artículo se llama “anisotropía de fluorescencia”.

Si está midiendo la afinidad de proteína-ADN, un método grosero pero más fácil es el ensayo de unión de filtro. Un método análogo es cuantitativo: EMSA. Produce una curva de asociación como lo hacen otros métodos. Por ejemplo:

(Las afinidades de los complejos de PRC2-RNA se analizaron usando EMSA cuantitativo. De: Nat Struct Mol Biol. 2013 Nov; 20 (11): 1250-7).

Un método bastante reciente para medir afinidades de unión molecular desarrollado por científicos alemanes se llama “Termoesférula de microescala”. Pero este método requiere un equipo bien ajustado que podría ser costoso comercialmente.

(De wikipedia)

Uno de los métodos para determinar la afinidad de un compuesto en particular por el ADN es el ensayo de huella de ADNasa. Hablando en términos simples, usamos una biblioteca de ADN idéntico y descomponemos el ADN en fragmentos usando una enzima ADNsa. Ahora volvemos a tomar el agente aglutinante en concentraciones crecientes y le permitimos interactuar con el ADN. Los sitios donde el agente se une al ADN no estarían fragmentados y podemos observar esta diferencia usando técnicas de electroforesis. Y al comparar la fragmentación del ADN a diferentes concentraciones del agente de unión, podemos determinar la concentración a la que se une al ADN de una manera significativa y, por lo tanto, su afinidad.

Bueno, no tengo una respuesta totalmente suficiente, pero tengo una idea.

El ADN tiene una carga negativa y es de naturaleza ácida (debido a la presencia del grupo fosfato). Entonces, cualquier cosa que sea básica y cargada positivamente se unirá al ADN. Como la proteína Histona que es responsable del sobrerrollamiento del ADN. Es una pequeña proteína ácida rica en lisina y arginina, que son responsables de la unión del ADN.

El resto depende del contexto en el que hagas esta pregunta.