En PCR, es decir, Reacción en cadena de la polimerasa, utilizamos Taq Polymerase (un tipo de ADN polimerasa I) que se aísla de la bacteria Thermo estable llamada Thermus aquaticus. No utilizamos la holoenzima de la ADN polimerasa que tiene alta procesividad debido a la pinza beta (abrazadera deslizante de ADN). La razón de esto es que la holoenzima de la ADN polimerasa III consiste en demasiadas subunidades. No es una proteína pequeña compuesta de un solo polipéptido similar a la del Taq Polymerase. Por lo tanto, el aislamiento de la ADN polimerasa como la holoenzima completa es difícil.
Además, durante la PCR, la fluctuación de temperatura es típica, ya que en cada ciclo, la temperatura aumenta y disminuye. Las holoenzimas de la ADN polimerasa III pueden perder su actividad y desnaturalizarse a alta temperatura. La renaturalización de proteínas / enzimas multisubunidad es difícil. Por lo tanto, no utilizamos holoenzimas de ADN polimerasa III en PCR.
Las polimerasas Taq son térmicamente estables. Pueden funcionar a alta temperatura con una tasa de fidelidad razonable. Sin embargo, la procesividad es menor en comparación con las holoenzimas de la ADN polimerasa III.
Recientemente hemos logrado desarrollar ADN polimerasa mutada que tiene una mayor capacidad de procesamiento en comparación con la polimerasa Taq utilizada tradicionalmente. Ejemplo: Thermo Scientific ™ Phusion High-Fidelity DNA Polymerase [1] , Agilent Technologies PFU ULTRA HIGH FIDELITY DNA [2] , Pfu-Ultra, etc.
Consulte el siguiente resumen del sitio web: Pfu Ultra DNA Polymerases y PCR Master Mixes
Se ha demostrado que la Pfu DNA polimerasa, derivada de la arqueobacteria hipertermofílica Pyrococcus furiosus , exhibe propiedades superiores de termoestabilidad y corrección en comparación con otras polimerasas termoestables. A diferencia de la Taq DNA polimerasa, la Pfu DNA polimerasa altamente termoestable posee una actividad de corrección de la exonucleasa 3 ‘-> 5’ que permite a la polimerasa corregir los errores de incorporación de nucleótidos erróneos.
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Ventajas de Pfu y sus versiones modificadas:
- Pfu exhibe la tasa de error más baja de cualquier ADN polimerasa termoestable
- Corrige los errores de incorporación errónea de nucleótidos con actividad de exonucleasa 3 ‘-> 5’ (corrección de pruebas)
- Cloned Pfu elimina manchas y fondo no deseado
- Reduce los tiempos de ejecución de PCR
- Aumenta la longitud de amplicón potencial
- Aumenta la integridad de la plantilla con una exposición mínima a las temperaturas del ciclo
Referencia y lecturas sugeridas:
- La respuesta de Keith Robison a ¿Cómo puede funcionar la PCR tan bien sin las proteínas de fijación de ADN? ¿No debería la ADN polimerasa perder su procesividad y liberar el sustrato de ADN después de algunas adiciones de nucleótidos?
- Brown, TA, 2016. Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción . John Wiley & Sons.
- PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase
- Pfu Ultra DNA Polymerases y PCR Master Mixes
Notas a pie de página
[1] Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase – Pruebas de diagnóstico y productos clínicos, productos químicos
[2] Agilent Technologies PFU ULTRA 2-HS2X MASTER
