¿El grosor de un Western Blot significa algo en absoluto?

Una transferencia Western se realiza haciendo primero electroforesis de proteínas, “secando” la imagen en una hoja de papel de filtro, y usando una mancha / anticuerpos para identificar dónde están las proteínas o identificar específicamente una proteína en particular.

Imagen aleatoria de Western Blot de internet

No estoy seguro de qué significa “grosor” en el contexto de esta pregunta, pero para una transferencia de western, las variables relevantes podrían ser la x, y, z del gel de agar y la densidad de la mancha.

En términos de X (eje horizontal), cada columna es una muestra particular.
En términos de Y, o cambio hacia arriba / hacia abajo, es una propiedad del tamaño de la proteína (que se separa por la electroforesis)
Si el grosor es el eje Z del gel, supongo que no tiene sentido y diluiría la muestra demasiado espesa, ya que el papel de filtro solo absorbería lo que está cerca de la superficie.

En términos de western blot, el “espesor” podría referirse a varios rasgos diferentes. David Ouyang hizo un muy buen trabajo resumiendo estos rasgos. Sin embargo, me gustaría agregar algunas aclaraciones:

En términos de Y, el tamaño de la proteína generalmente se correlaciona inversamente con la distancia de la banda desde la columna de carga inicial (las proteínas más pequeñas generalmente viajan más lejos en el gel que las proteínas más grandes). Sin embargo, se debe tener en cuenta que esta distancia depende de varios factores, incluidos el tamaño de la proteína, la estereoquímica de la proteína (forma geométrica), la presencia de residuos cargados (algunas cadenas laterales de aminoácidos están cargadas) en la proteína, la densidad del gel y el tipo de gel utilizado. Típicamente, se agrega SDS (dodecilsulfato de sodio) al tampón de carga y al gel para reducir los efectos de la estereoquímica variable. Los científicos suelen calentar sus mezclas de muestras de proteínas con SDS para eliminar las estructuras terciarias, etc. de las proteínas y linealizar las cadenas de polipéptidos. Si bien las diferencias de carga aún pueden afectar la distancia recorrida, esto es generalmente insignificante porque a través del espectro de aminoácidos involucrados en las diferentes proteínas es bastante aleatorizado en el diseño y los científicos suelen utilizar la distancia recorrida como una estimación aproximada del tamaño de la proteína.
En cuanto al grosor real de la banda en la membrana, este grosor se correlaciona directamente con la cantidad de una determinada proteína. Dado que las proteínas se transfieren a una membrana (p. Ej., Nitrocelulosa o PVDF), los científicos realizarán bloqueos, etc. y aplicarán anticuerpos específicos para las proteínas. El tamaño de la banda refleja la cantidad de anticuerpos unidos a la banda, así también la cantidad de proteína.

En términos de Z, si se refiere al grosor del gel en sí, las dimensiones del gel carecen de sentido para el marco teórico del procedimiento. Sin embargo, no debe hacer que el gel sea demasiado delgado o demasiado grueso en el eje z. Si el gel es demasiado delgado, será difícil de manejar y se puede romper fácilmente. Si el gel es demasiado grueso, puede afectar la integridad de la transferencia porque llevará mucho tiempo que las proteínas se transfieran por completo a la membrana. Mientras tanto, puede ocurrir cierto grado de difusión para ocultar los resultados.

Si está preguntando sobre el grosor de la banda, se debe a la cantidad de proteína que ha cargado.

Si pregunta por el grosor del gel con el que ejecuta las muestras, un gel más grueso hará que la electroforesis sea más lenta.