Tener cuidado con lo que deseas. La investigación más reciente muestra la edición CRISPR-Cas9 creando literalmente cientos de mutaciones inesperadas además de cambios en los cambios específicos. Los investigadores modificaron el gen Pde6b usando CRISPR-Cas9 para restaurar la vista en ratones ciegos. (Sí, eso cambiaría la canción infantil de los viejos niños :-). CRISP-Cas9 usa una secuencia específica codificada por un “único ARN guía” o ARN sgN cuya secuencia se supone que asegura que las mutaciones se realizan solo en las áreas de ADN que le corresponden. Sin embargo, después de que modificaron este gen, buscaron cualquier cambio genético no deseado (mutaciones AKA). Utilizaron la secuenciación del genoma completo (WGS) en el genoma murino completo (ADN de todos los ratones) buscando específicamente SNV (variantes de un solo nucleótido, mutaciones en las que solo se cambia una base de ADN). Además del cambio genético que curaría el tipo particular de ceguera que tenían los ratones, encontraron muchas otras mutaciones aleatorias que no se esperaban: más de 100 deleciones e inserciones pequeñas en el ADN y más de 1000 SNV. Como referencia, esta es aproximadamente 10 veces la cantidad de mutaciones que normalmente esperaría que ocurrieran a partir de errores aleatorios en la replicación del ADN de una generación a la siguiente en ratones.
La teoría era que si ocurrían cambios no deseados, ocurrirían en sitios en el ADN que tenían secuencias similares de ADN como el ARNg. Si esto fuera cierto, entonces las mutaciones podrían predecirse en este tipo de sitio en el ADN. Entonces los investigadores se sorprendieron cuando las nuevas mutaciones se encontraron en áreas de ADN que no eran similares al ARNg y no deberían haber sido afectadas. De hecho, cuando hicieron el estudio WGS en un segundo ratón tratado con CRISPR-Cas9 de la misma manera, la mayoría de las mutaciones secundarias (no deseadas) se encontraban en las mismas regiones que el primer ratón. Es importante destacar que estas mutaciones no se presentaron en un tercer control de ratón que no recibió la terapia CRISPR-Cas9, por lo que las mutaciones parecen ser causadas por el tratamiento. Claramente, no entendemos algo crítico sobre cómo funciona este sistema.
Para ser justos, la mayoría de estas mutaciones no estaban en regiones de ADN que causarían ningún cambio de función (o al menos cambios que conocemos y podemos medir actualmente). “Solo” tres a seis inserciones / eliminaciones y 50 o 60 de los SNV encontrados en los ratones experimentales se encontraban en regiones codificantes del ADN (aquellas que cuando son leídas producen ARNm, con el potencial de producir proteínas que pueden afectar el fenotipo [ características observables] de los ratones.) – + Los investigadores concluyen que “aunque nuestros ratones tratados con CRISPR no mostraron ningún fenotipo extraocular, es posible que los ratones puedan revelar fenotipos (nota: esto se refiere a los cambios negativos y notables causados por el mutaciones) en el tiempo … “
Pero hoy, nadie en su sano juicio querría exponerse a las células que han sido modificadas por CRISPR-Cas9 hasta (y si) estos problemas se han resuelto. Esto sería como la Ruleta Rusa, con la esperanza de que los cientos de mutaciones secundarias no causarían ningún daño.
Estoy adivinando que CRISP-Cas9 mejorará con la edad, de manera similar a otros sistemas biológicos que tomamos de bacterias y adaptadas para hacer nuestra oferta como enzimas de restricción (que cortan el ADN, pero solo en secuencias específicas, más o menos) o PCR (que se usa en medicina forense e investigación para multiplicar la cantidad de ADN por lo que hay suficiente para realizar pruebas, como en casos forenses). Este último usa una enzima Taq polimerasa involucrada en la replicación de la enzima de ADN que se encuentra originalmente en bacterias “termófilas” que crecen cerca del agua extremadamente caliente del océano cerca de respiraderos volcánicos donde antes se pensaba que la vida no podía existir. Las enzimas y los métodos de PCR se han modificado y mejorado mucho desde que el método se inventó en los años 80.
Para responder directamente a su pregunta, la forma más fácil de apuntar a tipos de células específicos es simplemente cultivar una cultura que contenga solo los tipos de células que desea modificar, como se hizo en el experimento en los tres ratones ciegos.
¿Qué hace sobreexpresar un gen en biología?
¿Son las proteínas las moléculas más abundantes y funcionalmente diversas en los sistemas vivos?
¿Cuál es el papel de las enzimas en las reacciones en su estado activo?
Para una noticia sobre esto, vea Los científicos que usan CRISPR descubren cientos de mutaciones involuntarias. Aquí hay algunos de los documentos originales para aquellos que están entrenados en bio molecular (o simplemente muy interesados):
- Documento de Nature Methods : mutaciones inesperadas después de la edición de CRISPRCas9 in vivo
- Nature Methods editorial, “Estándares CRISPR”
- La reparación de CRISPR revela una mutación causal en un modelo preclínico de retinitis pigmentosa (un tipo particular de ceguera)
