Cómo vincular un péptido señal con un anticuerpo

Mejora de la producción de anticuerpos de longitud completa mediante ingeniería de péptidos señal

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Abstracto

Fondo

La secreción de proteínas al periplasma de Escherichia coli ofrece una ruta atractiva para producir proteínas heterólogas que incluyen anticuerpos. En este enfoque, un péptido señal se fusiona al extremo N de la proteína heteróloga. El péptido señal media la translocación de la proteína heteróloga del citoplasma al periplasma y se escinde durante el proceso de translocación. Se mostró previamente que la optimización de la región de iniciación de la traducción (TIR) ​​que se solapa con la secuencia de nucleótidos de la secuencia señal mejora la producción de proteínas heterólogas. A pesar del progreso, todavía hay espacio para mejorar los rendimientos usando la secreción como un medio para producir complejos proteicos tales como anticuerpos monoclonales de longitud completa (mAbs).

Resultados

En este estudio identificamos la secreción ineficiente de la cadena pesada como la limitación para la acumulación de mAb de longitud completa en el periplasma. Para mejorar la secreción de la cadena pesada, investigamos los efectos de diversos péptidos señal en concentraciones TIR controladas. El péptido señal de la disulfuro oxidorreductasa (DsbA) mediaba una secreción más eficiente de la cadena pesada que los otros péptidos señal ensayados. Los estudios de mutagénesis demostraron que a niveles de traducción controlados, la hidrofobicidad del núcleo hidrofóbico (región H) del péptido señal es un factor crítico para la secreción de la cadena pesada y la acumulación de mAb de longitud completa en el periplasma. El aumento de la hidrofobicidad de un péptido señal potenciaba la secreción de la cadena pesada y los niveles periplásmicos de los mAb ensamblados de longitud completa, mientras que la disminución de la hidrofobicidad tenía el efecto opuesto.

Conclusiones

Este estudio demuestra que bajo intensidades de traducción similares, la hidrofobicidad del péptido señal desempeña un papel importante en la secreción de la cadena pesada. El aumento de la hidrofobicidad de la región H y el control de las resistencias TIR pueden servir como un enfoque para mejorar la secreción de la cadena pesada y la producción de mAb de longitud completa en E. coli .

Material suplementario electrónico

La versión en línea de este artículo (doi: 10.1186 / s12934-016-0445-3) contiene material complementario, que está disponible para usuarios autorizados.

Palabras clave: Anticuerpo monoclonal, péptido señal, Escherichia coli , secreción, producción de proteínas

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Fondo

La secreción de proteínas al periplasma de Escherichia coli ofrece una ruta atractiva para producir proteínas heterólogas que contienen enlaces disulfuro [1-4]. En este enfoque, el extremo N-terminal de la proteína heteróloga se fusiona con un péptido señal que media la translocación de la proteína desde el citoplasma al periplasma. El péptido señal se escinde durante el proceso de translocación. En comparación con la acumulación citoplásmica, la producción secretora de proteínas heterólogas tiene varias ventajas. En primer lugar, el aminoácido N-terminal nativo de la proteína heteróloga se mantiene después de que se escinde el péptido señal. En segundo lugar, el entorno oxidante y las enzimas en el periplasma facilitan la formación correcta de enlaces disulfuro [4]. Además, las bajas concentraciones de proteínas endógenas en el periplasma hacen que sea más fácil aislar la proteína heteróloga de los contaminantes de la proteína del huésped a escala de laboratorio [1, 3, 5-7].

A pesar de las ventajas, todavía es un desafío general utilizar la secreción como un medio para producir algunas proteínas heterólogas, especialmente complejos proteicos tales como mAbs de longitud completa [3, 8]. Las limitaciones incluyen la translocación ineficiente de proteínas heterólogas del citoplasma al periplasma y el procesamiento incompleto del péptido señal [3, 7, 9, 10]. Los precursores no procesados ​​tienden a agregarse y formar cuerpos de inclusión en el citoplasma [9, 11]. Como resultado, a menudo se informa que los rendimientos de proteínas heterólogas en el periplasma son bajos [1, 3].

Para mejorar la acumulación de proteínas en el periplasma, amplios estudios se han centrado en las estructuras primarias de los péptidos señal. Los péptidos señal se componen comúnmente de tres regiones distintas: una región N-terminal cargada, una región central hidrofóbica a menudo denominada región H, y una región C-terminal reconocida por la señal peptidasa [12, 13]. Una gran cantidad de bibliografía que usa proteínas de E. coli o proteínas de fusión como proteínas de carga sugiere que el aumento de la hidrofobicidad de la región H promueve la translocación de proteínas [14-24]. Sin embargo, algunos estudios de mutagénesis de la producción de proteínas heterólogas mostraron que el aumento de la hidrofobicidad del péptido señal no mejoraba los rendimientos [25-29].

Los estudios anteriores no tuvieron en cuenta la fuerza de traducción de los péptidos señal. La secuencia de nucleótidos del péptido señal se solapa con la región de inicio de la traducción (TIR) ​​que comienza inmediatamente aguas arriba de la secuencia de Shine-Dalgarno y se extiende a alrededor de 20 nucleótidos aguas abajo del codón de iniciación [30]. Los cambios en la secuencia TIR pueden afectar en gran medida la secreción y los niveles periplásmicos de proteínas heterólogas [31]. Los cambios en los residuos de aminoácidos en la porción N-terminal de la secuencia señal pueden alterar la fuerza de la traducción y hacer que sea difícil evaluar la causa subyacente de los efectos observados.

Para abordar este problema, controlamos la fuerza de traducción de diversos péptidos señal mediante mutagénesis silenciosa y analizamos sus efectos sobre la producción de mAbs de longitud completa. Nuestros resultados demostraron que bajo condiciones de fuerza de traducción similar, la hidrofobicidad del péptido señal es crítica para la secreción de cadena pesada en el periplasma. El aumento de la hidrofobicidad del péptido señal aumentó los niveles periplásmicos de la cadena pesada y aumentó adicionalmente el rendimiento de los mAbs ensamblados de longitud completa.

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Resultados

Producción de hu5D5 de longitud completa en el periplasma de E. coli y desafíos en la secreción de la cadena de anticuerpos

Comenzamos con un anticuerpo humanizado anti-MET hu5D5.v2 [32] (denominado hu5D5 en este estudio) como un modelo de IgG1 para estudiar la producción de mAb de longitud completa en el periplasma de E. coli . Se usó un vector de expresión de dos cistrones [33], en el que secuencias de cadena ligera y cadena pesada de hu5D5 se insertaron cada vez más abajo del promotor phoA , la secuencia trp Shine-Dalgarno y la secuencia señal de Enterotoxina II termoestable (ssSTII). Simmons et al. las variantes ssSTII construidas previamente con varios TIR [31] y mostraron que las menores resistencias TIR daban como resultado un aumento de la producción de mAb de longitud completa [33]. Con base en este estudio, utilizamos una variante ssSTII con una fuerza TIR relativa de 0.3 (ssSTII0.3) para la cadena ligera y una variante ssSTII con una fuerza TIR relativa de 1 (ssSTII1) para la cadena pesada. Las secuencias de ADN y las resistencias TIR relativas de las secuencias de señal se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S1. Las secuencias de aminoácidos correspondientes se enumeran en la Tabla 1. El vector de expresión se transformó en una cepa anfitriona deficiente en proteasas periplasmáticas 64B4 (archivo adicional 2: Tabla S2) y se indujo la expresión de la cadena del anticuerpo tras la depleción de fosfato en el cultivo del matraz agitado. Las células de E. coli que expresan hu5D5 formaron grandes cuerpos de inclusión en el citoplasma (Fig. 1b). E. coli que expresa el vector vacío no forma cuerpos de inclusión (Fig. 1a). Esta observación sugirió una secreción ineficiente de hu5D5 cadena ligera y / o pesada al periplasma. El microscopio electrónico Immunogold mostró que la cadena ligera de hu5D5 predominantemente localizada en el periplasma, mientras que la cadena pesada se localiza en el citoplasma (figura 1c, d), lo que indica que la cadena pesada de hu5D5 puede quedar atrapada en el citoplasma.

tabla 1

Las secuencias de aminoácidos del péptido señal TIR variantes

Figura 1

Microscopía electrónica de E. coli que expresa hu5D5 de longitud completa. a – b Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la cepa huésped 64B4 que expresa el vector vacío pBR322 ( a ) o pBR-ssSTII0.3-ssSTII1-hu5D5 ( b ). Las puntas de flecha blancas apuntan a cuerpos de inclusión …

Para confirmar que la secreción de la cadena pesada de hu5D5 era limitada, examinamos la apariencia del precursor y las cadenas de anticuerpos maduras. La forma precursora no secretada de una cadena de anticuerpo mantiene el péptido señal en el extremo N-terminal. Durante la translocación de proteínas, el péptido señal se escinde y, por lo tanto, la cadena madura secretada ya no contiene la secuencia del péptido señal [34, 35]. Para la cadena ligera de hu5D5, las formas precursora y madura se pueden distinguir por diferencias aparentes de peso molecular en SDS-PAGE. No se detectó ningún precursor de cadena ligera usando SDS-PAGE seguido de análisis de transferencia de Western para la cadena ligera. La secuenciación de Edman N-terminal mostró que la secuencia de señal se detectó parcialmente, sin embargo, el rendimiento de los aminoácidos era demasiado bajo para cuantificarse (datos no mostrados). Para la cadena pesada de hu5D5, se usó la secuenciación de Edman N-terminal para detectar el precursor y las formas maduras porque la pequeña diferencia en el peso molecular dificultaba la separación de las dos formas mediante SDS-PAGE. La interpretación de los datos de secuenciación mostró que menos de la mitad de la cantidad total de cadena pesada se secretaba (Tabla 2). Para eliminar la posibilidad de que la coexpresión de cadena ligera pueda interferir con la secreción de cadena pesada, expresamos cadena pesada con la secuencia señal STII en ausencia de cadena ligera, y no observamos un aumento en la eficacia de secreción de cadena pesada (Tabla 2). Por el contrario, no se detectó precursor cuando la cadena ligera hu5D5 se expresó sola (archivo adicional 3: figura S1). Tomados en conjunto, estos resultados demostraron que la secreción de la cadena pesada de hu5D5, pero no de la cadena ligera, era limitante.

Tabla 2

El procesamiento de la cadena pesada hu5D5 mediada por ssSTII, ssDsbA, ssPhoA y ssMalE con una fuerza TIR relativa de uno

El efecto de diversos péptidos señal en la secreción de la cadena pesada hu5D5 al periplasma

Con el fin de mejorar la secreción de la cadena pesada de hu5D5 al periplasma, probamos péptidos señal que representan dos vías principales de secreción bacteriana: la secuencia señal de DsbA (ssDsbA), que media la secreción co-traduccional y depende de la partícula de reconocimiento de señal (SRP ) [36]; y las secuencias señal de la proteína de unión a maltosa MalE y fosfatasa alcalina PhoA (ssMalE, ssPhoA), que median la secreción post-traduccional dependiente del segmento [37-40]. Para controlar las fuerzas traslacionales, utilizamos mutaciones silenciosas para generar variantes del péptido señal con varios TIR (ver sección “Métodos”). Las variantes ssSTII, ssDsbA, ssPhoA y ssMalE TIR con resistencias traslacionales relativas de ~ 1 (Archivo adicional 1: Tabla S1, nombradas como ssSTII1, ssDsbA1, ssPhoA1, ssMalE1) se fusionaron por separado a la cadena pesada hu5D5 y se probaron para determinar su capacidad de mediar la secreción de hu5D5 al periplasma en ausencia de cadena ligera.

La secuenciación de Edman N-terminal reveló que ssSTII1, ssMalE1 y ssPhoA1 dieron como resultado más precursor que la cadena pesada madura, mientras que ssDsbA1 condujo a cadena pesada más madura que el precursor (Tabla 2), si la cadena ligera se coexpresó o no. Colectivamente, con una fuerza TIR de ~ 1, ssDsbA mostró una mayor eficacia de secreción para la cadena pesada hu5D5 en comparación con ssSTII, ssPhoA y ssMalE.

El efecto de la hidrofobicidad del péptido señal en la secreción de la cadena pesada de hu5D5 a la fuerza TIR 1

Hemos tratado de comprender el mecanismo molecular de por qué ssDsbA mediada más eficiente de la secreción de la cadena pesada de hu5D5 en comparación con los otros péptidos señal probado. La mayoría de los péptidos señal de E. coli están compuestos de tres regiones distintas: una región N-terminal que contiene uno o dos residuos de aminoácidos cargados positivamente, una región central hidrofóbica a menudo denominada región H y una región C-terminal reconocida por la señal peptidasa [12, 13]. Una comparación entre ssSTII y ssDsbA mostró que tienen los mismos residuos N-terminales y pequeños restos de Ala en las posiciones -1 y -3 del sitio de escisión, lo que sugiere que los extremos N y C pueden no ser los factores clave que causan diferente eficiencia de secreción El cálculo de hidrofobicidad de los cuatro péptidos señal reveló que la región H de ssDsbA es más hidrófoba que la de ssSTII, ssMalE y ssPhoA (figura 2). Además, los estudios de múltiples péptidos señal sugieren que la hidrofobicidad de la región H es importante para la secreción de proteínas, aunque las fortalezas TIR de los péptidos señal no se controlaron en estos estudios [14, 16, 21, 41, 42]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la modulación de la hidrofobicidad de la región H y el control de la resistencia TIR podrían mejorar la secreción de la cadena pesada de hu5D5.

Figura 2

Las secuencias de aminoácidos de los péptidos señal y la hidrofobicidad de la región H El N-terminal, H-región y C-terminal se asignaron siguiendo la literatura previa [35, 42, 53, 60]. La hidrofobicidad media y suma de la región H se calcularon …

Para probar esta hipótesis, introdujimos cambios de un solo aminoácido en la región H de ssSTII y ssDsbA (Tabla 3). La región H de ssSTII contiene dos residuos polares de aminoácidos, Ser-13 y Ser-8. Para aumentar la hidrofobicidad de la región H, Ser-13 se mutó al residuo Leu o Ile; como un control Ser-13 también se mutó al residuo polar no cargado Tyr, que tiene hidrofobicidad similar a Ser (Tabla 3). Ser-8 no se modificó debido a la preocupación de que pueda afectar la escisión por la señal peptidasa. Las fuerzas TIR de las variantes de hidrofobicidad ssSTII se normalizaron a ~ 1 mediante mutaciones silenciosas de codones inestables (archivo adicional 1: tabla S1). En ausencia de coexpresión de cadena ligera, las sustituciones de S-13L y S-13I en ssSTII aumentaron la secreción de la cadena pesada de hu5D5 al periplasma (Tabla 3). El control S-13Y no aumentó la secreción (Tabla 3). También diseñamos una variante ssSTII TIR1 altamente hidrofóbica mediante la introducción de tres leucinas en la región H. ssSTII A-18L, A-14L, S-13L no mejoró la secreción de la cadena pesada hu5D5 por encima de los resultados obtenidos para S-13L (Tabla 3), lo que sugiere que los efectos de la hidrofobicidad de la región H alcanzaron una meseta. Similares efectos de meseta se observaron en un estudio que moduló la hidrofobicidad de ssPhoA [20]. Para ssDsbA, generamos variantes con hidrofobicidad disminuida mediante la mutación de Leu-9 a Ala, Ser o Gln (Tabla 3). Todas las variantes tienen una fuerza TIR de uno. En ausencia de cadena ligera, tanto L-9S como L-9Q dieron como resultado una disminución en la cadena pesada de hu5D5 secretada. L-9A pareció tener un impacto más modesto en la secreción de la cadena pesada hu5D5 (Tabla 3). Como control, reemplazando a Leu-9 con el residuo hidrófobo Ile no afectó la secreción de la cadena pesada de hu5D5 en comparación con la secuencia del péptido señal nativo (Tabla 3). Observamos efectos similares de la hidrofobicidad del péptido señal en la secreción de la cadena pesada de hu5D5 cuando la cadena ligera se coexpresó (Tabla 3). Colectivamente, con una fuerza TIR de 1, la hidrofobicidad de la región H es un factor crítico para la secreción eficiente de la cadena pesada hu5D5.

Tabla 3

Los efectos de la hidrofobicidad del péptido señal en el procesamiento de la cadena pesada hu5D5

Mejora de los niveles de hu5D5 de longitud completa ensamblados mediante la modulación de la hidrofobicidad del péptido señal a la fuerza TIR 1

A continuación preguntamos si la hidrofobicidad de la región H también afecta a la acumulación de hu5D5 de longitud completa ensamblada en el periplasma. Para probar esta idea, la cadena ligera hu5D5 se fusionó a ssSTII0.3 y la cadena pesada hu5D5 se fusionó a ssSTII1, ssDsbA1, ssPhoA1, ssMalE1, o las variantes de hidrofobicidad de la región H de ssSTII1 y ssDsbA1. Los niveles de hu5D5 soluble de cadena pesada y hu5D5 de longitud completa en el periplasma se examinaron mediante análisis de transferencia de Western (Fig. 3). ssDsbA1 dio como resultado una acumulación de hu5D5 de cadena pesada de hu5D5 más soluble y una acumulación de hu5D5 de longitud completa en el periplasma que ssSTII1, ssPhoA1 o ssMalE1. La disminución de la hidrofobicidad de la región H ssDsbA1 mediante el uso de L-9S dio como resultado niveles disminuidos de cadena pesada soluble y hu5D5 de longitud completa ensamblados en el periplasma (figura 3). Como control, ssDsbA L-9I no afectó a la acumulación periplásmica de la cadena pesada soluble y ensambló el hu5D5 de longitud completa. Para ssSTII, el aumento de la hidrofobicidad del péptido señal STII nativo mediante el uso de S-13L o S-13I aumentó la acumulación de cadena pesada y ensambló hu5D5 de longitud completa. No observamos ninguna correlación entre la hidrofobicidad de la región H y los niveles totales de la cadena pesada de hu5D5 en las células. Sin embargo, la cadena pesada de hu5D5 migró a un peso molecular aparente superior para ssMalE1, ssPhoA1 y ssDsbA L-9S. La secuenciación N-terminal confirmó que los componentes principales de estas bandas eran precursores de cadena pesada (tablas 2, 3) .3). Colectivamente, la hidrofobicidad de la región H del péptido señal desempeña un papel importante en la producción de hu5D5 de longitud completa, probablemente aumentando la cantidad de cadena pesada secretada al periplasma.

Fig. 3

Los efectos de la hidrofobicidad del péptido señal en la producción de hu5D5 de longitud completa. Para todas las construcciones, la cadena ligera se fusionó a ssSTII0.3 y la cadena pesada se fusionó a ssSTII1, ssDsbA1, ssPhoA1, ssMalE1, ssSTII1 S-13L, ssSTII1 S-13I, ssDsbA1 L-9S o ssDsbA …

La hidrofobicidad de la región H también influyó en la localización celular de los cuerpos de inclusión (figura 4). Los péptidos señal con una región H menos hidrofóbica fusionada a la cadena pesada hu5D5 (ssSTII1, ssPhoA1, ssMalE1 o ssDsbA1 L-9SS) dieron como resultado la formación de cuerpos de inclusión en el citoplasma, lo que sugiere que las proteínas se atraparon en el citoplasma y se agregaron. Por el contrario, los péptidos señal con una región H más hidrófoba (ssDsbA1 y ssSTII S-13L) dieron como resultado más cuerpos de inclusión en el periplasma, lo que indica que las proteínas se secretaban al periplasma y se agregaban. Las estrategias para optimizar el plegamiento de anticuerpos y evitar la agregación pueden mejorar aún más la producción de hu5D5 de longitud completa.

Fig. 4

Los efectos de la hidrofobicidad del péptido señal en la localización celular de los cuerpos de inclusión. TEM de E. coli que expresa pBR-ssSTII0.3-ssSTII1-hu5D5, pBR-ssSTII0.3-ssDsbA1-hu5D5, pBR-ssSTII0.3-ssMalE1-hu5D5, pBR-ssSTII0.3-ssPhoA1-hu5D5, pBR-ssSTI10. 3-ssSTII1 …

Los efectos de la hidrofobicidad del péptido señal en la producción de otros mAbs de longitud completa

Para probar si los efectos de la hidrofobicidad del péptido señal se aplican a otros mAbs de longitud completa, se incluyeron dos IgG1 adicionales (designadas como mAb1 y mAb2) en este estudio. Primero examinamos la secreción de la cadena pesada de mAb1 y la cadena pesada de mAb2 en ausencia de su cadena ligera correspondiente. Se descubrió que ssDsbA1 medía una secreción más eficaz tanto de la cadena pesada de mAb1 como de mAb2 en comparación con ssSTII1. El aumento de la hidrofobicidad de ssSTII1 con S-13L aumentó la eficiencia de secreción de ambas cadenas pesadas, mientras que la disminución de la hidrofobicidad de DsbA1 por L-9S tuvo el efecto opuesto (Tabla 4). Sin embargo, el impacto de L-9S en la secreción de la cadena pesada de mAb1 fue mayor que para la cadena pesada de mAb2 (Tabla 4).

Tabla 4

Los efectos de la hidrofobicidad del péptido señal sobre la secreción de la cadena pesada de mAb1 y mAb2

Para examinar los efectos de la hidrofobicidad del péptido señal en la producción de mAb1 y mAb2 de longitud completa, se usó ssSTII0.3 para cadena ligera y ssSTII1, ssDsbA1, ssSTII1 S-13L o ssDsbA1 L11S para cadena pesada. Se observó para mAb1 que aunque ssDsbA1 conducía a una acumulación de cadena pesada más soluble que ssSTII1, no conducía a cantidades aumentadas de mAb ensamblado de longitud completa (figura 5a). El uso de ssSTII1 S-13L incrementó los niveles tanto de la cadena pesada soluble como del mAb1 ensamblado de longitud completa en el periplasma, y ​​el uso de ssDsbA L-9S disminuyó los niveles de la cadena pesada soluble y ensambló el mAb1 de longitud completa (figura 5a). Sin embargo, las diferencias en los niveles de mAb1 no fueron tan dramáticas como las observadas para hu5D5. Para mAb2, los péptidos de señal más hidrofóbicos ssDsbA1 y ssSTII1 S-13L dieron como resultado niveles más altos de mAb de cadena completa soluble y ensamblada en el periplasma que los péptidos de señal menos hidrofóbicos ssSTII1 y ssDsbA1 L-9S (figura 5b). Estos resultados sugieren que la modulación de la hidrofobicidad del péptido señal impacta la acumulación de cadena pesada y puede afectar el ensamblaje de mAb1 y mAb2 de longitud completa. Es importante tener en cuenta que otros factores, tales como la eficacia del ensamblaje de anticuerpos y las interacciones de cadenas ligeras-cadenas pesadas, pueden limitar los niveles de mAbs de longitud completa en el periplasma.

Fig. 5

Los efectos de la hidrofobicidad del péptido señal en la producción de mAb1 y ( b ) mAb2 de longitud completa ( a ). Para todas las construcciones, la cadena ligera se fusionó a ssSTII0.3 y la cadena pesada se fusionó a ssSTII1, ssSTII1 S-13L, ssDsbA1 o ssDsbA1 L-9S. 64B4 que alberga …

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Discusión

La producción de mAbs aglicosilados de longitud completa en E. coli se ha demostrado previamente mediante la secreción de la cadena ligera y pesada en el periplasma donde se ensamblan los fragmentos de anticuerpo [33, 43, 44]. Sin embargo, la producción secretora de mAbs a menudo enfrenta desafíos tales como la agregación de proteínas, la degradación proteolítica y la secreción ineficiente [3]. En este estudio, encontramos que la secreción ineficiente de cadena pesada puede limitar potencialmente el nivel de mAb de longitud completa ensamblado en el periplasma. Pudimos mejorar la secreción de la cadena pesada y la acumulación de mAb usando un péptido señal con región hidrofóbica H a una fuerza de traducción controlada. La técnica de ingeniería del péptido señal presentada aquí también puede aplicarse para mejorar la producción secretora de otras proteínas heterólogas en bacterias y para expandir el rango de proteínas que pueden presentarse de manera eficiente mediante la visualización del fago [45].

Se consideraron dos aspectos para la ingeniería del péptido señal. Primero, introdujimos sustituciones de aminoácidos para aumentar la hidrofobicidad de la región H, un factor importante para la secreción de proteínas. En segundo lugar, debido a que los cambios de aminoácidos en las secuencias señal alteran la secuencia TIR y potencialmente cambian la fuerza de traducción, y debido a que la alta fuerza de traducción puede producir una secreción ineficiente de la proteína diana [31], usamos mutaciones silenciosas que cambian los pares de bases de oscilación en el secuencia de señal para controlar las intensidades de traducción. Muchos estudios previos sobre la mutagénesis del péptido señal mostraron que el aumento de la hidrofobicidad del péptido señal mejoró la translocación de proteínas [14-24], mientras que algunos estudios mostraron los resultados opuestos [25-29]. Las diferentes observaciones pueden deberse al uso de diferentes péptidos señal y / o proteínas de carga en estos estudios. Sin embargo, también es importante observar que estos estudios generalmente no controlaron la fuerza de traducción.

En E. coli , la mayoría de las proteínas secretadas se dirigen al translocon SecYEG a través de dos vías: la vía co-traduccional dependiente de SRP y la vía postraduccional independiente de SRP. En la vía de cotraducción, SRP se une co-traduccionalmente al péptido señal recién sintetizado en el ribosoma y dirige el complejo ribosoma-cadena naciente (RNC) al receptor SRP FtsY. Los RNCs se dirigen luego al translocon SecYEG donde la translocación ocurre simultáneamente con la traducción. En la ruta postraduccional, el polipéptido se libera del ribosoma como la forma precursora antes de la translocación. El precursor se dirige entonces a SecA y SecYEG unidos a la membrana en la membrana interna (revisado en [1]). Aunque los péptidos señal postraduccionales se han usado ampliamente para la producción de proteínas recombinantes, pueden no ser una buena opción para las proteínas recombinantes que se pliegan o se agregan rápidamente en el citoplasma [46]. Tales problemas podrían evitarse utilizando secuencias de señal dependientes de SRP. Con la vía de co-traducción, la traducción de la proteína, la translocación y el plegamiento están coordinados. Entre los péptidos señal ensayados, ssDsbA media la secreción co-traduccional [36], mientras que ssPhoA y ssMalE han demostrado mediar en la secreción postraduccional [37, 40]. De hecho, se observó que ssDsbA condujo a una secreción más eficiente de cadena pesada que los dos péptidos de señal postraduccionales (Tabla 2). Lee et al., También recientemente informaron que el uso de la secuencia señal DsbA para reemplazar la secuencia señal de PelB mejoró la producción de IgG de longitud completa [43]. No está claro si ssSTII media la secreción co-traduccional o post-traducción. La observación de un gran porcentaje de cadenas pesadas precursoras sugiere que ssSTII utiliza preferentemente la vía postraduccional, aunque no descarta la posibilidad de que ssSTII media la secreción de la cadena pesada a través de las vías postraduccional y co-traduccional. Se ha demostrado que algunas proteínas utilizan ambas vías para la secreción [34, 47]. Además, la expresión y secreción de proteínas recombinantes puede dar como resultado que se exceda la capacidad de una vía de secreción. En tal escenario, es posible que la secreción de proteínas utilice ambas rutas.

¿Cómo afecta la hidrofobicidad del péptido señal a la secreción de la cadena pesada? Una posible explicación es que un péptido señal menos hidrófobo tal como ssSTII usa preferentemente la ruta postraduccional. Es probable que los precursores de la cadena pesada se doblen o se agreguen en el citoplasma y se vuelvan incompetentes para la secreción. El aumento de la hidrofobicidad de la región H podría redirigir la cadena pesada a la vía de secreción de cotraduccional y evitar el plegamiento o la agregación de la cadena pesada en el citoplasma. Esta hipótesis está respaldada por estudios que muestran que los péptidos de señal hidrofóbicos interactúan con SPR más eficientemente [48-50] y a menudo median en la secreción de cotraducción [24, 51]. Alternativamente, es posible que el aumento de la hidrofobicidad del péptido señal resulte en una interacción más eficiente entre el precursor de la cadena pesada y SecA [48] o las chaperonas citoplásmicas.

Además de la hidrofobicidad del péptido señal y las resistencias TIR, otros factores también pueden afectar la secreción de la cadena del anticuerpo. Por ejemplo, se ha demostrado que un aminoácido con carga positiva en el extremo N de la secuencia señal promueve la interacción con SRP [52]. El contenido de alfa-hélice en la secuencia de señal también es importante para la secreción eficiente [53, 54]. La composición de aminoácidos de C-terminal es crítica para la división del péptido señal [35]. Además, varios estudios han demostrado que los péptidos señal pueden modular el plegamiento, la estabilidad termodinámica y las propensiones de agregación de las proteínas de carga [55, 56]. Con la vía de secreción postraduccional, las interacciones entre el péptido señal y la cadena pesada en el citoplasma pueden afectar la eficacia de la secreción.

Usando la ingeniería de péptidos señal, aumentamos los rendimientos de hu5D5 en los cultivos de matraces oscilantes aproximadamente 2,5-3 veces. Muchos factores quedan por probar para optimizar aún más la acumulación de mAb de longitud completa en el periplasma. Por ejemplo, la coexpresión de los componentes clave de la maquinaria de secreción puede aumentar adicionalmente la secreción de la cadena del anticuerpo. Se ha demostrado que la sobreexpresión de SRP (Ffh) aumenta los rendimientos de IgG de longitud completa [43], presumiblemente debido a una mayor eficacia de secreción. Además, de acuerdo con nuestros resultados preliminares, sospechamos que la cadena pesada y la cadena ligera pueden competir por la capacidad de secreción limitada. Por lo tanto, es posible que sea necesario ajustar con precisión la relación entre la cadena ligera y la cadena pesada. Además, la cadena ligera secretada y la cadena pesada pueden formar especies dímeras o agregados en el periplasma (Figuras 3,, 5) .5). La coexpresión de chaperones periplásmicos proporciona una estrategia factible para evitar la agregación de proteínas y aumentar los rendimientos de los mAb [8, 43, 44].

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Conclusiones

Escherichia coli es un vehículo atractivo para la producción de proteínas terapéuticas. Sin embargo, sigue siendo un reto lograr altos rendimientos para proteínas complejas de subunidades múltiples que incluyen mAbs de longitud completa. En este estudio demostramos que uno de los cuellos de botella para la producción de mAbs ensamblados de longitud completa es la secreción de cadena pesada hacia el periplasma. La ingeniería del péptido señal controlando la resistencia TIR y aumentando la hidrofobicidad de la región H mejoró la eficacia de la secreción de la cadena pesada en el periplasma y mejoró adicionalmente la acumulación de varios mAbs de longitud completa. La tecnología descrita aquí ofrece un enfoque eficaz para la producción de mAbs de longitud completa en E. coli .

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Métodos

Cepas y plásmidos

Las cepas y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en el archivo adicional 2: Tabla S2. Para construir vectores de expresión, los fragmentos de ADN de cadena pesada o cadena ligera que contienen el promotor phoA y la secuencia señal se clonaron en un vector de expresión derivado de pBR322 [33]. Para construir plásmidos informadores phoA para la medición de la fuerza de la traducción, los fragmentos que contienen las secuencias del péptido señal se clonaron aguas arriba del gen reportero phoA en el vector pPhoA86 [31]. Se introdujeron mutaciones específicas de sitio adicionales en secuencias de péptido señal mediante el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene). La secuencia de cada plásmido se confirmó mediante secuenciación de ADN (Genentech Inc.).

Construcción de bibliotecas TIR de péptido señal

Bibliotecas de secuencias de señal con un rango de fuerza traslacional se generaron como se describe anteriormente [31, 57]. Brevemente, se usaron oligos degenerados para introducir mutaciones silenciosas en los primeros siete codones de secuencias de señal de stII , dsbA , malE y phoA . Los sitios de restricción de XbaI , BssHII o MluI se insertaron aguas arriba del codón de inicio para diversificar la región TIR. Las secuencias variantes TIR se insertaron cadena arriba del gen phoA maduro en el plásmido pPhoA81. Los constructos se transformaron en la cepa huésped 27C7. Los transformantes se plaquearon en placas de agar LB que contenían carbenicilina y 100 μg / ml del sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP, Sigma) y se hicieron crecer a 37 ° C durante la noche. Se seleccionaron colonias con color azul claro o azul oscuro para la extracción y secuenciación del plásmido (Genentech, Inc.).

Medida traslacional de la fuerza

Las fuerzas de traducción de las variantes del péptido señal se determinaron mediante el ensayo de fosfatasa alcalina usando para-nitrofenilfosfato como sustrato. [31, 57].

Inducción de la expresión del anticuerpo

Los cultivos bacterianos se cultivaron en Luria-Bertani (LB) o en medio completo limitador de fosfato CRAP [33] que contenía antibióticos a 37 ° C oa 30 ° C, como se indica. Se usaron las siguientes concentraciones de antibióticos: carbenicilina 50 μg / ml y tetraciclina 20 μg / ml. Para la expresión proteica, la cepa huésped 64B4 que alberga el vector de expresión del anticuerpo se inoculó en 5 ml de LB suplementado con 20 μl / ml de tetraciclina y fosfato sódico 5 mM, pH 7 en un tubo de cultivo de polipropileno y se incubó a 30ºC con agitación durante la noche. sobredosis

550

del cultivo nocturno se midió para asegurar que la cepa no tuviera defectos de crecimiento. Se inocularon 0,5 ml del cultivo de una noche en 25 ml de CRAP completo suplementado con 20 \ mu L / ml de tetraciclina en un matraz de agitación con deflectores de 125 ml y las células se cultivaron a 30ºC con agitación durante 24 h. La densidad óptica del cultivo a las 7 y 24 h se midió a 550 nm.

Extracción de proteínas y análisis de Western Blot

Se recogieron muestras de punto final de cultivos de matraces con agitación para análisis de transferencia Western. Para medir los niveles totales de la cadena pesada, 1 ml de 1 OD

550

de bacterias se centrifugó, se lisó en 200 μL de tampón de SDS de tricina con ditiotreitol 0,2 M (DTT, Sigma) y se calentó a 95 ° C durante 5 min.

Para extraer las proteínas solubles, se utilizó un enfoque de sonicación descrito anteriormente [57] porque dio como resultado resultados más reproducibles y un mayor enriquecimiento de cadenas de anticuerpos en comparación con el método de choque osmótico convencional. Brevemente, el caldo de células enteras se diluyó en tampón de lisis enfriado (Tris 10 mM, pH 6,8, EDTA 5 mM, lisozima 0,2 mg / ml y ácido yodoacético 5 mM) hasta una OD final.

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de 3.0. Luego se sonicaron 600 μL de muestras usando dos rondas de pulsos de 10 × 1 sy se centrifugaron durante 15 min a 16,000 xg a 4 ° C. Se recogió el sobrenadante para SDS-PAGE y análisis de transferencia Western. Para la extracción de proteínas periplasmáticas, 10 OD

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de las bacterias se sedimentaron y se resuspendieron en tampón TBS (Tris 200 mM, pH 8,0, sacarosa 0,5 mM, EDTA 1 mM) con 1 tableta de cóctel inhibidor de proteasa (Roche) como se describe [58]. Las muestras de proteínas solubles o los extractos periplásmicos se mezclaron 1: 1 (v / v) con tampón de tricina SDS con o sin DTT 0,2 M y luego se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia de Western. Las intensidades de carril en geles teñidos con Coomassie se usaron como control de carga. Se sondearon especies que contenían cadenas pesadas con anticuerpo Fc de cabra antihumano conjugado con HRP (Pierce). Se sondearon especies que contenían cadena ligera con anticuerpo de cabra anti-kLC de cabra conjugado con HRP (Bethyl Laboratories). Las proteínas diana en inmunoblots se detectaron mediante quimioluminiscencia potenciada (GE Healthcare).

Secuenciación de Edman del extremo N de la cadena pesada

Las muestras del punto final de los cultivos del matraz de agitación se normalizaron a 4 OD

550

y cosechado por centrifugación a 16,000 × g por 3 min. Los lisados ​​celulares completos resuspendidos en 200 μl de tampón SDS de tricina que contenía DTT 0,2 M se cargaron en SDS-PAGE Bis-Tris al 10%. Después de la separación electroforética, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF usando transferencia húmeda (Biorad) en tampón CAPS. La banda de la cadena pesada a ~ 50 kDa en la membrana se escindió y se sometió a análisis de secuenciación de Edman usando Applied Biosystems Procise Sequencer Modelo 494HT. Los valores de Picomole de cada aminoácido se calcularon mediante el programa de análisis de secuencias SEQX normalizado frente a los estándares de aminoácidos de feniltiohidantoína no corregida [59]. Se usó un promedio de 10 ciclos para producir el gráfico de rendimiento repetitivo para calcular la regresión lineal, y los rendimientos iniciales de las secuencias mayor y menor se definieron como las intersecciones y de las líneas trazadas. La eficiencia de procesamiento de la cadena pesada se calculó como el porcentaje de cadena pesada madura, que es igual al rendimiento inicial

maduro

/ (Rendimiento inicial

maduro

+ Rendimiento inicial

precursor

)

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Las muestras del punto final de los cultivos de matraces se recogieron inmediatamente, se sedimentaron en gránulos de 50-100 μL y se resuspendieron en 1 ml de fijador de Karnovsky modificado (paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,2). luego se fija luego en tetróxido de osmio acuoso al 1% (EM Sciences, Hatfield, PA) durante 1 h, seguido de una incubación durante la noche en acetato de uranilo al 0,5% a 4 ° C. Las muestras se deshidrataron luego a través de una serie de concentraciones crecientes de etanol (50, 70, 90, 100%), seguido de óxido de propileno (cada paso fue durante 15 minutos) y se incrustó en Eponate 12 (Ted Pella, Redding, CA). Se cortaron secciones ultrafinas (80 nm) con un microtomo Ultracut (Leica), se tiñeron con 0,2% de citrato de plomo y se examinaron usando un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1400 (TEM) a 120 kV. Las imágenes digitales se capturaron con una cámara GATAN Ultrascan 1000 CCD.

Microscopía electrónica Immunogold (inmunoEM)

Para los experimentos con inmunoanálisis EM, las muestras se prepararon primero para la criosección. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% con glutaraldehído al 0,1% en tampón de fosfato (0,1 M, pH 7,2), se lavaron varias veces en PBS, se incrustaron en gelatina al 12% y se infiltraron en sacarosa 2,3 M durante la noche a 4ºC. Luego se montaron las muestras en pernos para la crio-ultramicrotomía congelada en una cámara de criosección (suministrada con nitrógeno líquido). Se prepararon criosecciones ultrafinas (100 nm) con una cuchilla de diamante (Diatome) a -80ºC usando un ultramicrotomo (Ultracut; Leica) equipado con una cámara de criosección. Las criosecciones descongeladas se transfirieron a rejillas EM recubiertas con formvar y carbono (níquel) con una gota de sacarosa 2,3 M, inmunomarcadas (véase a continuación) y luego se contratiñeron para EM con acetato de uranilo al 0,5% en metilcelulosa al 2% durante 1 minuto a temperatura ambiente. Para el etiquetado de inmuno, las criosecciones descongeladas en rejillas se bloquearon en agente bloqueante (Aurion Inc) durante 30 min y se incubaron con una cadena anti-luz (LC) o anticuerpo de cabra anti-cadena pesada (Fc) conjugado con HRP durante 45 minutos en la habitación temperatura, seguido de incubación con un anticuerpo de cabra conjugado con oro anti-HRP (Jackson ImmunoResearch) durante 30 min. Las secciones se contratiñeron como se describió anteriormente. Las secciones marcadas con inmunoglobulina se visualizaron y examinaron en un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1400 (TEM) a 120 kV. Las imágenes digitales se capturaron con una cámara GATAN Ultrascan 1000 CCD.

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Contribuciones de los autores

YZ diseñó los experimentos y analizó los datos. DR supervisó la investigación. YZ y DR escribieron el manuscrito. YG, PL y WS realizaron la secuenciación de Edman y analizaron los datos de secuenciación. AKK, MR y LR realizaron el TEM y el análisis de datos. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Expresiones de gratitud

Agradecemos al laboratorio de preparación de plásmidos de ADN y al laboratorio Media Prep de Genentech por proporcionar los reactivos de investigación. Reconocemos el laboratorio de secuenciación de ADN en Genentech para secuenciar los constructos. Reconocemos a Matthew Marrichi por la construcción de la biblioteca TIR del péptido señal. Agradecemos a Laura Simmons, Christoph Spiess, Scott Chamberlain, Thomas Patapoff y al grupo E. Coli de Early Stage Cell Culture por las útiles discusiones.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Para más información, visite la Síntesis de péptidos , síntesis de péptidos personalizada