Depende de cómo quieras hacer esto.
En primer lugar, es posible que desee agregar más en su experimento real. Perdón por la dureza, pero por la naturaleza de la pregunta (¿por qué no simplemente colocas los codones en los cebadores?) Supongo que crees que estas proteínas funcionarán cuando se fusionen. Puede que no. De hecho, todas las proteínas que he intentado fusionar, aparte de GFP, ¡han fallado invariablemente al funcionar!
Entonces, ¿cuál es tu organismo objetivo? Quieres que tu uso de codones coincida con el del organismo. Por ejemplo, si estoy usando E coli, puedo usar GGC GGT GGC TCT (si mi memoria me sirve correctamente en el uso). El GGT se usa para que no haya demasiada repetición, por lo general ayuda en la posterior reacción de gibson / SLiCE.
Si su cebador tiene 20 pb de recocido (aunque desea optimizar esta calculadora NEB tm), los cebadores deberían tener un aspecto similar a este en la región de unión para un gibson-
NNNN GGC GGT GGC TCT NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CCG CCA CCG AGA NNNN
¿Puede dañarse el ARN, causando el procesamiento anormal de proteínas?
¿Cómo se puede encontrar la enzima Rubisco?
Los Ns tienen una superposición de 20 pb con el opuesto. De hecho, si solo está haciendo PCR de un plásmido, puede circularizarlo directamente en las células de E. coli (el SS320 es el que yo uso). Si hay más fragmentos, probablemente debería usar un gibson real. (Usar un gibson real aumentará la eficiencia)
Si desea usar enzimas restrictivas, use un Tipo IIS como BsaI y superposición de diseño en el sitio de corte. Es bastante simple y corta fuera del sitio de reconocimiento, lo que permite secuencias muy específicas para recocer y clonar. También puede usar BamHI y BglII (vea BglBricks para más información) pero eso no le permite optimizar el codón.
