La electroforesis en gel es un proceso mediante el cual, usando corrientes eléctricas en un medio de gel, las moléculas se pueden clasificar en función del tamaño, la polaridad o la carga. Hay tres principales protocolos generales para la electroforesis, la mancha del norte, la mancha del sur y la mancha del oeste. El propósito de estos protocolos es separar ARN, ADN y proteínas, respectivamente. Los borrones norte y sur funcionan de maneras bastante similares.
En ambos casos, el gel se prepara de antemano en un tanque de electroforesis. Se coloca un peine en el tanque para que se produzcan pequeñas hendiduras, llamadas pozos, en el gel a medida que se solidifica.
el ácido nucleico se trata para hacerlo fluorescente bajo luz UV. La muestra se vierte en los pozos. Al menos un pozo, quizás más dependiendo de la cantidad de muestras que esté ejecutando, está reservado para un “estándar”, una solución que contiene moléculas de tamaño conocido, que se puede usar para estimar el tamaño de las moléculas en su muestra. Cuando se enciende la máquina, se aplicará una carga eléctrica al gel, lo que provocará que los grupos de fosfato cargados negativamente en los ácidos nucleicos se muevan a través del gel en la dirección del terminal positivo. Las cadenas más largas de ADN o ARN se moverán más lentamente que las cadenas más cortas, lo que dará como resultado una separación de las moléculas en función de su tamaño. El resultado final será una serie de líneas en el gel, como esta.
A la izquierda tienes tu estándar. En cada otro carril, ha ordenado montones de ADN separados por tamaño. Si sabe qué estándar se está utilizando, puede comparar la ubicación de las líneas en su muestra con la ubicación de las líneas en su estándar para estimar el tamaño de cada fragmento de ADN.
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Ahora, ¿por qué es esto útil? Bueno, es una buena forma de comparar el ADN. Ver, hay enzimas, llamadas enzimas de restricción, diseñadas para cortar el ADN en una secuencia particular, llamada sitio de restricción. Si arrojas ADN con algunas enzimas de restricción conocidas, cortarán ese ADN en fragmentos de diferentes tamaños, dependiendo de dónde se encuentren los sitios de restricción. Dado que los individuos varían en las ubicaciones de sus sitios de restricción, diferentes individuos producirán fragmentos de diferentes tamaños. Esta es una de las formas en que se realizan prácticas como el análisis forense de ADN y las pruebas de paternidad. Digamos que tenemos muestras de ADN de la escena del crimen y cuatro posibles sospechosos.
Bueno, Bob, Sue y Lisa pueden ser descartados inmediatamente. Sus muestras no coinciden con la muestra de la escena del crimen. John lo hace. Eso no significa que pueda estar 100% seguro de haber cometido el crimen basándose únicamente en la evidencia de ADN. Un familiar cercano puede compartir varios de sus sitios de restricción, por ejemplo, y no se prueban todos los posibles sitios de restricción. Sin embargo, si tiene otra evidencia que lo hizo sospechar de John, esta es una buena indicación de que probablemente sea el tipo que está buscando.
Otro uso es verificar los que trabajan en transformación y experimentos de edición genética. Si agrega un gen a un sitio en particular en un área con sitios de restricción conocidos, puede verificar que la transformación fue exitosa cortando el ADN con enzimas de restricción y ver si el fragmento donde intentó insertar su gen aumentó o no. Si es del mismo tamaño, no hay ADN añadido y tu transformación no se realizó. Si es más largo, eso significa que el ADN que agregaste ingresó allí y tu transformación fue exitosa.
Aquí tenemos un vector plasmídico utilizado para hacer que las bacterias brillen en la oscuridad. Se divide con dos enzimas diferentes, primero por separado y luego juntas. Si este plásmido es absorbido por la bacteria que intentas transformar, entonces deberías esperar ver estas líneas si digieres la muestra con las mismas enzimas, junto con las otras líneas producidas por el resto del genoma bacteriano. Si estas líneas no están allí, probablemente su plásmido no esté presente en la muestra y la transformación haya sido un fracaso. Por supuesto, en este caso sabrá si tuvo éxito porque su plato se vería así:
Las transferencias Western son más complicadas que las transferencias Northern o Southern porque no todas las proteínas se cargan de la misma manera. Interpretarlos, por esta razón, requiere mucha más habilidad y experiencia que los borrones discutidos anteriormente. Habilidad y experiencia que en gran medida no tengo. Puedo decir que el proceso general es similar al descrito anteriormente. El gel se prepara, las proteínas se desnaturalizan, se tratan para que brillen y se vierten en los pocillos. Se moverán según su tamaño y su carga. A diferencia del ADN y el ARN, las diferentes proteínas pueden moverse en diferentes direcciones oa velocidades variables según el grado y el tipo de carga que poseen.
