Si se pregunta cómo se determina la identidad de los productos de reacción enzimática, la respuesta es simplemente la misma que identificaría cualquier compuesto orgánico: mediante una combinación de métodos, que incluyen espectroscopía, cromatografía, espectrometría de masas, polarimetría, etc.
Para determinar la cantidad de producto, depende de la naturaleza química del producto. A menudo, la parte más difícil de estudiar una reacción enzimática es averiguar cómo medir la acumulación de producto a lo largo del tiempo. Algunos productos químicos pueden rastrearse utilizando espectros de absorbancia característicos. Por ejemplo, el fumarato, el producto de la enzima succinato deshidrogenasa, absorbe la luz ultravioleta a una longitud de onda de ~ 210 nm, lo cual es bueno porque es poco probable que otros componentes del ensayo oculten esta longitud de onda. Otra forma de medir el producto, especialmente uno que de otra manera no se puede rastrear fácilmente por espectroscopia, es realizar una reacción secundaria que use el producto para formar algo que pueda cuantificar fácilmente. Un ejemplo sería el complejo piruvato deshidrogenasa, que convierte el piruvato en acetil CoA. El Acetil CoA no es fácil de medir directamente, pero si agrega NAD + a la reacción (y se necesita algún tipo de oxidante) para reactivar el cofactor FADH2, observará una acumulación estequiométrica de NADH (que absorbe a 340 nm) en proporción a la cantidad de acetil CoA producido. Esto se llama un ensayo enzimático acoplado. En mi investigación, a menudo me interesa medir cuánto azúcar libera una enzima que descompone un polisacárido. La mayoría de los azúcares, como la glucosa, no absorben la luz en el espectro UV-visible. Después de que la enzima reacciona durante un cierto período de tiempo, mezclo la solución del producto con el ácido dinitrosalicílico (DNS), que cambia de amarillo a rojo cuando se reduce por aldosas o cetosas. Este ensayo fue inventado hace casi 60 años y todavía se usa ampliamente en el campo.
El desarrollo del ensayo enzimático puede ser extremadamente desafiante, pero usted puede ser creativo y aprender mucho sobre la química bio-orgánica en el proceso.
