Usando el mapeo de epítopes
Existen varios métodos disponibles para mapear epítopos de anticuerpos en antígenos diana:
Co-cristalografía de rayos X : el método estándar de oro que permite la visualización directa de la interacción entre el antígeno y el anticuerpo. Este enfoque es técnicamente desafiante, requiere grandes cantidades de proteína purificada y puede consumir mucho tiempo y ser costoso.
Escaneo de oligo-péptidos basado en matriz (a veces llamado escaneo peptídico superpuesto o análisis pepscan): esta técnica usa una biblioteca de secuencias de oligo-péptidos de segmentos solapantes y no solapantes de una proteína diana y prueba su capacidad de unirse al anticuerpo de interés . Este método es rápido y relativamente barato, y específicamente adecuado para epítopes de perfil para una gran cantidad de anticuerpos candidatos contra un objetivo definido. Combinando secuencias de péptidos no adyacentes de diferentes partes de la proteína diana y reforzando la rigidez conformacional en este péptido combinado (tal como mediante el uso de andamios CLIPS), los epítopos discontinuos pueden mapearse con muy alta confiabilidad y precisión.
Mutagénesis dirigida al sitio : Usando este enfoque, se introducen mutaciones sistemáticas de aminoácidos en una secuencia de proteína seguida por la medición de la unión del anticuerpo con el fin de identificar aminoácidos que comprenden un epítopo. Esta técnica se puede usar para mapear tanto epítopes lineales como conformacionales, pero es laboriosa y lenta, típicamente limitando el análisis a un pequeño número de residuos de aminoácidos.
Mapeo de mutagénesis de alto rendimiento .
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Este enfoque utiliza una biblioteca de mutaciones integral, con cada clon que contiene una mutación de aminoácido única (conservativa, no conservativa o alanina) y la biblioteca completa que cubre cada aminoácido en la proteína diana. Cientos de clones plasmídicos de la biblioteca de mutaciones se disponen individualmente en microplacas de 384 pocillos, se expresan en células de mamífero y se analizan para determinar la unión del anticuerpo. Los aminoácidos que se requieren para la unión del anticuerpo pueden identificarse por una pérdida de reactividad fluorescente y mapearse en estructuras de proteínas para visualizar epítopos.
Una base de datos personalizada permite administrar toda la información de mutagénesis de manera sistemática, precisa y eficiente. La base de datos también realiza los cálculos estadísticos utilizados en todo el análisis de datos y el refinamiento de los epítopos, incluidos los algoritmos patentados para derivar los epítopes finales.
Hasta la fecha, esta “acuñado mutagénesis” se ha utilizado para construir bibliotecas de mutaciones que suman más de 10.000 mutaciones puntuales individuales, que representan proteínas de la envoltura viral [virus dengue-3 (DENV-3) prM / E, DENV-4 prM / E, chikungunya virus E2 / E1, hepatitis C E1 / E2, antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, proteína sincitial del virus respiratorio F y VIH gp160], proteínas GPCR (CCR5, CXCR2, CXCR4 y TAS2R16), proteínas 4TM (claudina-1 y claudina-4) y otras proteínas de membrana (MCAM-1 y Her-2).
El enfoque de mutagénesis Shotgun ha sido utilizado para epítope mapa cientos de mAb dirigidos a DENV (que representa una de las mayores colecciones de información de epítopos contra una proteína viral), virus chikungunya y virus de hepatitis C, con epítopos de mAb adicionales mapeados en virus de hepatitis B, sincitial respiratorio virus y VIH.
También se ha usado para definir epítopos de mAb de nivel atómico en los GPCR CCR5 y CXCR4, la identificación de epítopos de biomarcador de cáncer en las proteínas 4TM claudina 1 y claudina 4, un modelo de nivel atómico que describe la vía de transducción de señal intramolecular de CXCR4 , un mecanismo propuesto para la especificidad y sensibilidad del ligando de GPCR TAS2R16, mapeo de sitios de unión a inhibidor en TAS2R16, y mapeo de residuos paratope en un anticuerpo clínico contra virus sincicial respiratorio.
Intercambio de hidrógeno-deuterio : método que crece en popularidad y que proporciona información sobre el acceso del disolvente a diversas partes del antígeno y el anticuerpo, lo que demuestra una accesibilidad reducida al disolvente en el que se producen interacciones entre proteínas.
Otros métodos, tales como presentación en fagos y proteólisis limitada, proporcionan una monitorización de alto rendimiento de la unión de anticuerpos pero carecen de fiabilidad, especialmente para epítopos conformacionales.
