Durante la glucólisis, la energía se utiliza en forma de ATP en dos pasos diferentes (en la primera mitad de la glucólisis). Las moléculas de ATP donan grupos de fosfato de alta energía en el paso 1 con hexoquinasa y el paso 3 con fosfofructocinasa. Una información detallada de estos dos pasos es la siguiente:
El primer paso de la glucólisis en la que se utiliza energía es la conversión de D-glucosa en glucosa-6-fosfato. Esta es la primera reacción de la glucólisis catalizada por la enzima hexoquinasa. En este proceso, se consume una molécula de ATP y se libera una molécula de ADP.
El segundo paso de la glucólisis en la que se utiliza energía es la conversión de fructosa 6-fosfato en fructosa 1,6-bisfosfato. Esta es la tercera reacción de la glucólisis catalizada por la enzima fosfofructocinasa en presencia de magnesio como cofactor. En este proceso, se consume una molécula de ATP y se libera una molécula de ADP.
En general, en la glucólisis entera, se utilizan dos moléculas de ATP como fuente de energía para llevar a cabo la descomposición de una molécula de glucosa.
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Sin embargo, durante todo el proceso, una molécula de glucosa produce cuatro ATP y dos NADH (2X2 = 4 ATP). Como se utilizan dos moléculas de ATP, se produce una ganancia neta de 2ATP y 2 NADH durante la glucólisis.