Queremos programar las interacciones ADN-proteína
Desde los inicios de la biología molecular, hemos estado buscando maneras de localizar proteínas a cualquier secuencia de ADN específica y arbitraria dentro de una célula.
Queremos hacer esto porque las proteínas generalmente hacen todo el ‘trabajo pesado’ en biología molecular, y una vez que se obtiene una proteína para adherirse a un fragmento de ADN, esa proteína puede hacer lo suyo, ya sea cortando el ADN (nucleasas) , insertando / reemplazando ADN (recombinasas), mutando el ADN (deaminasas), deteniendo la expresión génica (dominios represores), iniciando la expresión génica (dominios de activación), etc.
Una de las aplicaciones más interesantes de esto es modificar el genoma de una célula: si puede cortar específicamente en un determinado sitio en el genoma, es posible utilizar una variedad de métodos para cambiar la secuencia de ADN en esa ubicación.
Por ejemplo, supongamos que desea cortar una determinada secuencia de ADN única en el genoma, ‘AATAGGAGATTCATGGGACT’. Tal vez esta secuencia está dentro de un gen que quieres mutar. Para hacer un corte específicamente en esta ubicación, podría dirigir una proteína de nucleasa aquí uniéndola físicamente (fusionándola) a otra proteína que se una específicamente a esa secuencia de ADN. Tendría que expresar esta proteína de fusión en la célula y buscar las células donde se hizo el corte.
Cómo lo hicimos antes de CRISPRs
Debido a que esta es una interacción bastante fundamental, los organismos tienen muchas proteínas que se unen al ADN. Pero debido a que las proteínas tienen que interactuar físicamente con el ADN, y la estructura de las proteínas es difícil de predecir, encontrar proteínas que se unan a su secuencia de ADN de interés no es una tarea fácil.
Pero, afortunadamente, a la evolución también le ha resultado difícil esta tarea, por lo que en muchos casos sigue reutilizando el mismo andamio de proteínas, copiando y modificando la misma proteína una y otra vez para que se una a secuencias ligeramente diferentes. Algunas de estas proteínas también son modulares, lo que significa que consisten en varias unidades repetidas de proteínas más pequeñas que pueden unirse. Al unir estos módulos, se pueden diseñar nuevas proteínas que unen diferentes secuencias de ADN.
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Dedos de zinc
Los dedos de zinc son omnipresentes en genomas eucariotas y se descubrieron desde el principio como una clase de proteína modular de unión al ADN. Cada módulo de dedo de zinc une 3 bases, y por lo general se usan en grupos de 3 módulos, por lo que cada matriz de tres dedos se une a 9 bases de ADN. Pero en los 3 mil millones de bases del genoma humano, 9 bases no es probable que sea único. Además, no todos los dedos de zinc funcionan igual (algunos son tóxicos) y muchas combinaciones de dedos de zinc no funcionan bien juntas. Debido a esto, debe tener muchos dedos de zinc diferentes, y es difícil saber cuáles funcionarán de antemano. Además de todo eso, algunas matrices de dedos de zinc no son tan específicas, secuencias de unión que están a pocas bases del objetivo deseado.
Transcriptor Activador-como efectores (CUENTOS)
Esta clase de proteínas modulares se encontró más recientemente (en una bacteria que infecta a las plantas) y fue la respuesta a todos los problemas con los dedos de zinc, hasta que apareció CRISPR. A diferencia de los dedos de zinc, cada unidad de proteína se une a una base, por lo que son mucho más fáciles de unir, y solo necesita cambiar dos aminoácidos por módulo para cambiar la base a la que se une. Pero debido a que necesita un monómero de proteína para cada base de ADN, está buscando una proteína bastante grande y repetitiva, y eso ha dificultado la creación de CUENTAS de forma rápida y económica.
OK, ¿por qué son CRISPR diferentes?
El “sistema CRISPR” se encontró inicialmente como parte de un “sistema inmunológico” de algún tipo en algunas bacterias, utilizado para eliminar el ADN extraño. Realmente consta de dos partes: la proteína misma, llamada cas9, y un pequeño ARN, llamado ARN guía (en realidad hay algunas piezas más, pero estas son las dos principales que se dirigen al ADN) .
En el caso de CRISPR, es el ARN que es complementario al objetivo de ADN, no la proteína. Predecir cómo una proteína se plegará y contactará con el ADN es difícil, pero todo el mundo sabe cómo interactúan el ADN y el ARN: ¡solo se basa en secuencias complementarias!
Esto hace que sea increíblemente fácil apuntar a cualquier secuencia de ADN, simplemente cambie el extremo comercial del ARN de la guía CRISPR al complemento inverso de su objetivo. La proteína cas9 interactúa con el ARN guía y corta el ADN al que está unido el ARN. Incluso puede eliminar la actividad de corte de cas9 y fusionarla con otras proteínas, para detener o iniciar la expresión de genes particulares, por ejemplo.
Algunos otros beneficios:
- La proteína cas9 funciona “directamente de la caja” en las células humanas, lo cual es bastante espectacular, ¡ya que proviene de bacterias!
- Mientras que cas9 es una gran proteína, el ARN guía de CRISPR en sí es bastante pequeño, lo que permite que se pueda expresar, modificar, insertar en las células y sintetizar desde cero. Incluso es posible crear bibliotecas con miles de ARN guía, cada uno de los cuales tiene como objetivo una secuencia única diferente. ¡Compare esto con la dificultad de hacer incluso un CUENTO simple, o preocupándose si alguno de los dedos de cinc que ensambló funcionará correctamente!
- Cada secuencia de ARN guía une aproximadamente 20 bases de ADN, lo que permite mucha más especificidad que los dedos de zinc, casi a la par con los TALES.
Desventajas?
- Todavía es temprano, por lo que todavía hay dudas sobre la especificidad de los CRISPR (hasta ahora se parecen a los TALE), y hasta ahora no parecen ser muy tóxicos cuando se expresan en células humanas.
Entonces, ¿cómo va a cambiar esto las cosas?
Con CRISPRs, podemos dirigir más fácilmente y con precisión el ADN en las células. Esta es una nueva herramienta enorme en nuestro kit de herramientas que será útil para todo, desde la biotecnología agrícola hasta la producción de biocombustibles y biomateriales y la terapia génica para enfermedades humanas.
Algunas referencias
Ingeniería del genoma humano guiada por ARN a través de Cas9.
Ingeniería de genoma multiplex usando sistemas CRISPR / Cas.
Regulación guiada por ARN modulada mediada por CRISPR de Transc … [Cell. 2013]
Agrupado palindrómico corto interparesado regularmente … [Biol Chem. 2011]
Represión programable y activación de … [Nucleic Acids Res. 2013]
Edición del genoma guiado por ARN en plantas usando un CRISPR … [Mol Plant. 2013]