Los fragmentos de ADN más pequeños se encontrarán cerca del fondo del gel, mientras que los fragmentos más pesados se encontrarán en la parte superior. La razón de esto es que hay un cierto tamaño de poro en función de la concentración de agarosa / acrilamida en el gel. No importa el tamaño de poro, a los fragmentos más pequeños les será más fácil migrar a través del gel que los fragmentos más grandes para un tamaño de poro dado, por lo que se observa ese patrón. Finalmente, el tamaño generalmente se calcula ejecutando una escalera con marcadores de peso molecular específicos conocidos. Puede comparar su muestra con los marcadores de peso molecular conocidos y de ese modo estimar el tamaño de su muestra de ADN
¿Dónde se encontrarán los fragmentos más pequeños de ADN en un gel después de que se ejecute? ¿Dónde se encontrarán los fragmentos más grandes? ¿Cómo se determina el tamaño?
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Depende fuertemente de qué tan denso es el gel. Para fragmentos de ADN extremadamente pequeños, use un gel de poliacrilamida. Para fragmentos de ADN medianos, como 800 bases hasta varias kilobases, use como un 1% de agarosa
gel. los fragmentos más pequeños corren más rápido y más lejos, y se encontrarán más alejados de los pozos de carga. los fragmentos más pesados corren más lentamente y cubren la distancia más corta, por lo que se encontrarán más cerca de los pozos de carga.
Para determinar el tamaño de los fragmentos en su gel, debe cargar un carril con fragmentos de ADN de tamaño conocido. Si no tiene una línea de fragmentos de ADN de “tamaño estándar” de tamaño conocido, será increíblemente difícil determinar el tamaño de los fragmentos de ADN experimentales.
por ejemplo, use lambda phage DNA cut con Hin D III (también llamado hind iii). aquí: en la foto de arriba, los pozos de carga están en la parte superior de la imagen: el fragmento de 23Kb es muy pesado, por lo que ha recorrido la distancia más corta, por lo que está más cerca de los pozos de carga. el fragmento de base 564 es el fragmento más ligero, por lo que ha recorrido la distancia más lejana, por lo que está más alejado de los pozos de carga.
Algunas muy buenas respuestas aquí, así que solo quiero agregar algunos consejos mientras hago esto. 1. Mientras se configura, asegúrese de que los pozos estén en el extremo del cable negro del tanque (este es el lado negativo). Entonces su ADN pasará de Negativo a Positivo (rojo), ya que el ADN está cargado negativamente.
2. Prefiero usar una escalera Thermo DNA 1Kb +, ya que esto te proporciona bandas claras en posiciones útiles.
3. La concentración de agarosa del gel te dará una idea de la separación. Los geles con alta concentración (1 a 2% de geles) solo se usan si todos sus fragmentos son pequeños y necesita separación de fragmentos de tamaño similar. Si solo necesita separar una cadena principal de plásmido digerida, es mejor usar un gel de 0.5-0.8% para que cuando extraiga ADN del gel, no tenga demasiados problemas de purificación.
Para imaginarlo simplemente, el gel de agarosa forma una matriz para que el ADN pelee y llegue al lado rojo al que se lo atrae. Si el ADN es más pequeño, puede deslizarse entre los huecos de la matriz y viajar más rápido en el gel. Los fragmentos de ADN más grandes enfrentan más obstrucción, por lo que quedan atrás. Por lo tanto, los fragmentos pequeños viajarán más, mientras que los grandes viajarán menos.
¡Espero que esto ayude!
El tamaño de la ADN fragmentada se descubrirá mediante SDS PAGE (electroforesis en gel). Hay un gráfico estándar según el cual detectamos nuestra banda de interst y podemos determinar el mol.wt. fragmentos menores de menta están en la parte inferior y más grandes en la parte superior (para la página vertical)
