No lo sé con certeza, pero mi mejor suposición es que hay dos estrategias que se emplean para limitar la actividad de 5 ‘exo en el conjunto de Gibson. La primera es que la mayoría de las mezclas maestras usan una pequeña cantidad de exonucleasa T5 (la exo 5 ‘utilizada en la mayoría de los protocolos de Gibson): una reacción típica de 20 μL usando la mezcla maestra casera detallada aquí usa 0.08 unidades de enzima. Compare eso con las 4 unidades de enzima utilizadas en una reacción “estándar” de tamaño equivalente, y está usando 50 veces menos exonucleasa T5.
La segunda forma en que la actividad de T5 exo es limitada es la temperatura elevada a la que se realiza el ensamblaje de Gibson. T5 exo tiene una temperatura óptima de 37 grados, mientras que Gibson se realiza a 50 grados. Esto casi seguramente disminuye la actividad de T5 exo, pero probablemente también hace que se desnaturalice rápidamente a lo largo de la escala de tiempo de la reacción. Estoy dispuesto a apostar a que la actividad de T5 exo en una reacción de ensamblaje Gibson está completamente muerta dentro de los primeros 10 minutos, asegurándote de que la actividad de masticación no destruya todo tu ADN.
