¿Cuáles son las ventajas del sistema de expresión pET sobre otros vectores?

El sistema de expresión pET es un excelente sistema cuando desea producir una gran cantidad de una proteína deseada. Hay varias ventajas clave:

• El promotor T7 es uno de los promotores conocidos más fuertes. Puede producir mucha proteína. ¡Incluso leí que podría producir suficiente proteína para representar aproximadamente el 50% del contenido total de proteína de la célula!
• Los plásmidos pET tienen muchos sitios de restricción comunes, especialmente frente al promotor T7, pero también en otros lugares.
• El promotor T7 muy fuerte está regulado por el operador lac. Además, los plásmidos codifican su propio represor lac, por lo que si trabajas con cepas inusuales u otros tipos de bacterias deficientes en el represor lac, no tendrás ningún problema. Esto también reduce la filtración del promotor.
• Los plásmidos pET tienen un número de copia medio. (~ 20-25 por celda). Esto puede ser útil porque evita que pasen cosas raras debido a números de copias que son demasiado altos o demasiado bajos. Permite el alto nivel de expresión del promotor T7 sin sobrecargar la célula con muchas copias del plásmido además. También debería dar rendimientos razonables en minipreparaciones, a diferencia de algunos plásmidos de bajo número de copias.
• Es bastante común que las empresas estén dispuestas a proporcionarlo como parte de los servicios. Por ejemplo, he solicitado vectores PET como columna vertebral para genes sintetizados artificialmente y características genéticas de una compañía de síntesis de genes.
• Hay, por supuesto, los marcadores seleccionables usuales y todo eso.

Si tuviera que sugerir un vector PET para comenzar, probaría pET11a. Es bueno para aplicaciones que implican la expresión directa de proteínas. La etiqueta T7 n-terminal se puede eliminar cortándola durante la clonación o puede retenerse si la necesita.

Una cosa a tener en cuenta cuando se utiliza el sistema pET es que, a pesar de la regulación del represor lac, a veces puede ser un poco permeable (en ocasiones hasta 5% de expresión). Entonces, si su proteína tendrá efectos dramáticos en pequeñas cantidades, esta podría no ser la mejor opción. Además, las proteínas muy hidrófobas pueden tener cierta toxicidad, por lo que deben evitarse al usar este sistema. Otra cosa para reconocer: solo puedes obtener inducción parcial desde 0.1 mM IPTG. Necesita 1.0 mM IPTG para obtener una expresión completa. Finalmente, se debe tener en cuenta que se necesita una cepa con el casete (DE3) o alguna otra forma de expresión de la ARN polimerasa T7 para activar el promotor T7. Sugeriría BL21 (DE3) o BL21 (DE3) pLysS. (Este último tiene algunas propiedades para reducir la toxicidad de las proteínas a las células después de la inducción).

Recomiendo encarecidamente este sistema, ya que lo he utilizado con éxito en el pasado. ¡Buena suerte!