En primer lugar, según el comentario de la pregunta, debe distinguir entre seguimiento y caracterización.
El seguimiento , en el sentido de seguir la cinética de una reacción sin conocer necesariamente la identidad de la especie involucrada, se puede realizar con cualquier instrumento que pueda:
- Mezcle el sustrato y la enzima lo suficientemente rápido para que se pueda seguir la cinética. La rapidez con que deben mezclarse depende de la escala de tiempo de la reacción. [1] Para reacciones lentas, la difusión simple o una barra de agitación es suficiente (hacen cubetas especiales que se ajustarán a las barras de agitación más pequeñas [2]). Para la mayoría de las reacciones enzimáticas, necesitará un espectrómetro de flujo de detención para terminar de mezclar en milisegundos con la esperanza de seguir la reacción [3] [4]
- Algún método de distinguir las señales.
Stopped-flow: El resultado de este experimento es un decaimiento generalmente multiexponencial, que se puede ajustar para obtener las constantes de velocidad de los pasos de reacción. [5] Para rastrear la reacción, todo lo que importa es que las señales son diferentes. Para caracterizar la reacción, las señales deben ser interpretables en términos de estructura química. Esto generalmente no es cierto para la fluorescencia. [6] [7] Muchos intermedios catalíticos tampoco son fluorescentes. La absorbancia es mejor, pero la predicción sigue siendo inexacta (aunque esto no importa si el intermedio es lo suficientemente estable como para tener una muestra a la mano) y los espectros de muchos compuestos se superponen. [8] El flujo interrumpido FT-IR puede proporcionar una identificación parcial ya que algunos picos IR están estrechamente asociados con grupos funcionales específicos. [9] [10] La RMN puede dar una caracterización completa, pero incluso la 1D RMN suele ser demasiado lenta para detectar intermedios para todas las enzimas, excepto las más lentas (pero consulte aquí un ejemplo interesante de los siguientes productos enzimáticos in vivo mediante MRI).
La cristalografía de resolución temporal puede caracterizar por completo la reacción [11], pero todavía está en la etapa de prueba de principio y es poco probable que se convierta en una técnica de rutina debido a sus condiciones muy exigentes. En ausencia de métodos directos, debe recurrir a técnicas más indirectas. Los residuos de mutación en el sitio activo a veces pueden dar una idea de los compuestos intermedios formados al romper interacciones cruciales.
Tomando todo esto en consideración, el mejor método es probablemente un experimento de flujo detenido detenido con el flujo detenido conectado a un espectrómetro de masas. [12] [13] [14] La especificación de masa sirve como lectura para el flujo detenido. Estos experimentos se pueden ejecutar en modo apagado, [15] donde una jeringa separada con un inhibidor sirve para detener la reacción, o en modo de flujo continuo con los productos arrastrados. [16] Estos experimentos no son fáciles de configurar y no creo que los instrumentos estén disponibles comercialmente, pero eliminan cualquier ambigüedad que pueda tener sobre lo que tiene.
¿Qué campos dentro de las ciencias de la vida tienen el futuro más prometedor?
¿Es posible predecir el cambio en la conformación de una proteína después de unirse a un ligando?
Notas a pie de página
[1] Aspectos prácticos de la medición de las tasas iniciales y los parámetros de reacción
[2] AKM-5200-0106 | Barras de revolver micro magnéticas de 2 x 2 mm de PTFE – Qorpak
[3] Resolución de la cinética: métodos rápidos
[4] http://www.chem.tamu.edu/rgroup/…
[5] Evaluación de la cinética química intrínseca y espectros transitorios de productos de datos espectroscópicos resueltos en el tiempo.
[6] ¿Es posible predecir computacionalmente las propiedades de fluorescencia de una molécula?
[7] Predicción de tiempos de vida de fluorescencia y espectros de biopolímeros.
[8] Una introducción a la ciencia de la enzima
[9] La espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier de flujo detenido permite la monitorización continua de la reducción de azida, la inhibición del monóxido de carbono y la hidrólisis del ATP mediante la Nitrogenasa – Bioquímica (Publicaciones de ACS)
[10] Estudios espectroscópicos infrarrojos y Raman de la estructura y función de la enzima.
[11] Biología: Cristalografía resuelta en el tiempo
[12] De las reacciones de moléculas pequeñas al plegamiento de proteínas: estudio de la cinética bioquímica mediante espectrometría de masas por electronebulización de flujo detenido
[13] Espectrometría de masas contemporánea para la detección directa de intermediarios enzimáticos.
[14] Monitoreo de conversiones enzimáticas por espectrometría de masas: una revisión crítica
[15] Investigación de la cinética enzimática utilizando técnicas de enfriamiento rápido con espectrometría de masas MALDI-TOF
[16] Monitoreo en línea de reacciones enzimáticas utilizando espectrometría de masa de ionización por electronebulización por desorción de tiempo determinado.
