Estás haciendo una serie de preguntas no necesariamente relacionadas. ¿Qué sucede después de realizar una PCR? ¿Cómo se usa el resultado de una PCR para modificar un organismo y cómo se realiza una mutación knockout?
Todas las modificaciones genéticas que realicé se realizaron en genes bacterianos, donde la modificación genética es mucho más fácil que en organismos eucarióticos, pero incluso para las bacterias hay múltiples respuestas a todas las preguntas. Trataré de responder algunos y quizás te lleve a obtener más respuestas en otro lugar.
La mayoría de las modificaciones que realicé se realizaron antes de la PCR real. Las modificaciones se realizaron en el cebador durante el diseño del cebador, estas fueron en su mayoría modificaciones individuales, dubbel o de base triple, junto con un sitio de restricción. Puede comprar una cartilla de su propio diseño de empresas de biotecnología. Cuando estaba haciendo este tipo de trabajo, los cebadores estaban limitados a unas 50 bases, no sé si este es todavía el caso. Este tipo de método es algo limitado en su uso por el límite de tamaño, debe haber sitios de restricción viables cerca del sitio de modificación.
El producto de PRC se limpió entonces (kit de purificación de PCR) y se ligó al gen de interés y a continuación se restringió de nuevo y se ligó en un plásmido que luego se transformó en una bacteria. Existirían una serie de pasos de electroforesis en gel para verificar los productos de la modificación, restricción y ligación. Había un gen antibiótico resistente en el plásmido para seleccionar las bacterias transformadas cultivándolas en un medio con un antibiótico. Un presto; un organismo modificado, si fuera tan fácil. No siempre es lo planeado y no siempre se puede encontrar dónde está el problema.
Un gen knockout se puede realizar en más de una forma. La forma más fácil que conozco es mediante el uso de la interferencia de ARN. Incluyes un plásmido con la versión complementaria del ARN mensajero para el gen que quieres eliminar. Este ARNm complementario formará luego ARN bicatenario con el ARNm diana. La célula degrada el ARN bicatenario y no quedará ARNm para conducir a la expresión génica, silenciando eficazmente el gen. (Hay alguna expresión génica residual usando este método, fuente)
El tercer enlace que agregué a continuación es, muy probablemente, de una presentación sobre el gen knockout. Que analiza algunos de los procesos utilizados para la eliminación de genes.
¿Cuál es el mecanismo de la ADN primasa?
¿Para qué sirve secuenciar el genoma de uno?
¿Por qué las etapas de desnaturalización y extensión de PCR son más largas en su primer ciclo?
¿El ADN contiene algo más que el código para fabricar proteínas?
Interferencia de ARN
Gene knockout
http://www.genesil.com/docs/Knoc…
