¿Cómo funcionan los ensayos de pulldown?

El ensayo de reducción de proteínas es un método de purificación de afinidad in vitro que utiliza una proteína de cebo para enriquecer las proteínas que interactúan con la proteína del cebo. Puede usarse para la confirmación de la interacción proteica existente descubierta por otras técnicas o la detección inicial para identificar nuevas interacciones proteína-proteína.

El principio básico del ensayo de extracción es utilizar una proteína fusionada con etiqueta (como GST-tag, His-tag y biotin-tag) inmovilizada en resina de afinidad como proteína de cebo . Las proteínas que se unen a la proteína del cebo (proteína de presa ) pueden capturarse y “reducirse” cuando la proteína diana o el lisado celular fluye. Mediante la elución y el análisis posteriores mediante Western Blot o espectrometría de masas (MS), se puede confirmar una interacción pronosticada o se pueden descubrir interacciones previamente desconocidas.

Los ensayos pull-down son realmente sencillos.

Hipótesis: la proteína A se une a la proteína B.

Principio: Si A se une fuertemente a B, entonces si purifica A, debería poder detectar B.

Experimentar:

  1. Cree un plásmido que codifique la proteína A unida a una etiqueta (por ejemplo, HA, Myc, Flag, GST, MBP, His, etc.)
  2. Exprese la proteína A en un organismo de su interés.
  3. Purificar la proteína A.
  4. Exprese la proteína B en un organismo de su interés.
  5. Mezcle las proteínas A y B juntas.
  6. Agregue algunas perlas conjugadas con un anticuerpo contra la etiqueta unida a la proteína A.
  7. Haga girar las cuentas y elimine el sobrenadante.
  8. Lavar las cuentas
  9. Hervir las perlas en un tampón de desnaturalización y ejecutar las muestras en un gel.

Resultados:

  • Si detecta bandas para A y B en su gel, existe una interacción entre A y B.
  • Si no hay bandas para B, no hay interacción.

Nota : Esta es una explicación extremadamente simplificada sobre cómo configurar los ensayos desplegables. Los procedimientos experimentales reales se pueden modificar enormemente según las características de las proteínas que se estudian. Por ejemplo, un ensayo alternativo al pull-down está derribando proteínas que interactúan in vivo mediante ensayos de inmunoprecipitación (IP) o coinmunoprecipitación (Co-IP). Los principios en todos los casos son esencialmente los mismos: si dos proteínas interactúan, y usted puede purificar una, la otra debería aparecer como un compañero vinculante.