Los genes de resistencia a los antibióticos se usan típicamente en vectores:
- Plásmidos: ADN circular extracromosómico que se replica autónomamente en células bacterianas
- Los bacteriófagos (en mucha menor medida) -vectores derivados del bacteriófago lambda
- cósmido: elemento circular extracromosómico que combina las características de los plásmidos y los vectores del bacteriófago lambda.
- y finalmente, los cromosomas artificiales bacterianos (los llamados vectores BAC) -construidos utilizando el plásmido F bacteriano, de modo que pueda contener una copia por célula.
El concepto básico es que-
el gen extraño a clonar se inserta entre el grupo de genes resistentes a antibióticos presentes en el vector, durante el proceso de clonación. Como resultado, las moléculas recombinantes, es decir, las que llevan el vector junto con el gen de interés en el grupo de genes resistentes a antibióticos perderá su resistencia a los antibióticos.
Para seleccionar estas moléculas recombinantes, cultivamos las células en un medio que contiene el antibiótico particular.
Naturalmente, solo las células que NO crecen en dicho medio se identifican como recombinantes y se purifican y separan adicionalmente.
Para que quede más claro, déjame darte un ejemplo simple:
El plásmido pBR322 tiene un grupo de genes de tetraciclina así como un grupo de genes resistentes a la ampicilina.
El gen de tetraciclina tiene un único sitio de clonación múltiple para las enzimas de restricción EcoRI, SalI, BamHI y el gen de ampicilina tiene la secuencia de reconocimiento PstI.
El gen de interés se empalma en, digamos, el grupo de genes resistentes a tetraciclina. Luego se introducen en las células de E. coli mediante técnicas de transformación. Se obtienen tres tipos de células:
1.Las células no transformadas: no contienen moléculas plasmídicas y, naturalmente, no son resistentes a la tetraciclina ni a la ampicilina.
2.Las células TRANSFORMADAS: contienen moléculas de plásmido SIN el gen de interés en el grupo de genes de tetraciclina. Estas células son resistentes tanto a tetraciclina como a ampicilina.
3.Las células RECOMBINANTES -contienen moléculas plasmídicas con el gen de interés empalmado en el grupo de genes de tetraciclina- por lo tanto, pierden su resistencia a la tetraciclina. Sin embargo, recuerde que el gen no se empalma en el gen para resistencia a la ampicilina, por lo tanto retienen su resistencia a la ampicilina.
Ahora, las células se agregan a un cultivo y se hacen crecer, luego se colocan en un medio que contiene ampicilina.
¿Qué pasaría?
Todas las células excepto la no transformada podrán crecer. Esto se llama control positivo.
Luego, colocamos las células en un medio que contiene tetraciclina + ampicilina
¿Qué pasaría?
Solo las células transformadas (aviso, no recombinante) podrán crecer
Por lo tanto, ahora hemos identificado las células recombinantes y podemos ampliarlas para su uso posterior.
Además de esto, los genes de resistencia a antibióticos se usan generalmente para insertar los sitios de clonación múltiple (MCS), ya que su interrupción no obstaculizará las capacidades de replicación del plásmido (y por supuesto, la selección fácil).
