¿Por qué la expresión libre de células es mejor que el sistema de células Baculovirus-insecto para la expresión de GPCR?

En pocas palabras, el sistema libre de células en teoría debería funcionar mejor que el sistema de Baculovirus. El único problema es que solo unos pocos laboratorios en el mundo están configurados para aumentar la síntesis de proteínas sin células ya que las materias primas son difíciles de conseguir. Compare eso con una industria de ciencias biológicas bien engrasada (relativamente) construida alrededor del sistema de Baculovirus.

Tendrás la tendencia a encontrar que los laboratorios de cristalografía se quedarán con lo que se sienten cómodos y lo que funcionaría. Sin embargo, para los GPCR, nada funciona realmente pero dado que el sistema de Baculovirus está produciendo algunos resultados, todos están satisfechos con el producto.

Para responder la pregunta sobre por qué el sistema sin células es mejor, el entorno abierto del sistema sin células permite un mejor control del entorno químico. Como resultado, uno puede ajustar el potencial redox y ajustar la concentración de varios surfactantes, cosas que no se pueden hacer en una celda cerrada. Además, como solo produce una sola proteína, la purificación de los GPCR es significativamente menos difícil que la producción heterogénea.

Estoy de acuerdo con Christopher VanLang, la gente tiende a quedarse con lo que funcionó antes. Sin embargo, la creación de un laboratorio para la celda libre
la síntesis de proteínas (CFPS) usando extracto de E. coli no tiene que ser extremadamente
costoso, especialmente si lo compara con los precios de compra
kits comerciales de CFPS. Se necesitan equipos de laboratorio básicos como prensa francesa, centrífugas, etc. y productos químicos disponibles en la mayoría de los proveedores de productos químicos.
Lo que le costará es el tiempo de arranque. Toma un tiempo establecer un
protocolo de trabajo y pruebas de calidad para garantizar un rendimiento confiable de
el extracto. Esto es lo que creo que es lo que hace que las personas duden en probarlo en primer lugar. Una vez configurado, es realmente simple y efectivo en el tiempo de uso.

Muchos GPCR expresan extremadamente bien en un sistema CFPS. El problema es que es difícil conseguirlos en estado completamente funcional y plegado. Es difícil obtener modificaciones postraduccionales en lugares correctos, como la palmitoilación y los puentes disulfuro, que pueden ser esenciales para la actividad y la funcionalidad. Como se dijo anteriormente, los GPCR son notoriamente difíciles de trabajar y tienden a agregarse y fallar, especialmente en las altas concentraciones necesarias para la biología estructural. Encontrar la condición correcta para hacer muestras estables requiere una gran cantidad de pruebas. Este es el modo de lote CFPS realmente brilla. La configuración del cribado de detergentes y otros aditivos es solo una cuestión de hacer una mezcla maestra, distribuirla en tubos eppendorf y pipetear los detergentes que se van a cribar. Un par de horas más tarde y un western blot y sabrá qué condición produjo la mayor cantidad de proteína.

Los CFPS se usan hoy en día para producir muestras de proteínas de membrana para la biología estructural, como puede verse en el creciente número de publicaciones.