Una enzima de restricción reconoce una secuencia específica (exclusiva de cada enzima) y realiza un corte. Por ejemplo, EcoRI reconoce la secuencia de nucleótidos GAATTC y la corta de modo que se convierta en dos fragmentos con voladizos como se muestra en la siguiente imagen
Tenga en cuenta que no se elimina / agrega ningún nucleótido. Si la secuencia está religada, nuevamente es la misma secuencia.
Para la digestión de restricción, todo lo que necesita es un ADN, una enzima y condiciones de tampón específicas.
Sin embargo, las cosas son un poco complicadas en CRISPR / Cas9. Aquí puede elegir cualquier sitio en el ADN siempre que se cumplan algunos criterios como una secuencia PAM (requerida para el reconocimiento de Cas9, nGG, n = cualquier nucleótido).
así es como va
1) elige un sitio de destino
2) diseñar un ARN guía polinucleotídico que contenga bases complementarias de su sitio diana (la parte del ARN guía que se une al ADN diana) y el resto de la secuencia se requiere para un plegamiento conformacional adecuado para el reconocimiento por la enzima Cas9 (burbuja azul).
3) Inyectar los embriones / tratar las células (yo trabajo con embriones de rana) con a. guía RNA, b. Enzima Cas9 (ya sea ARNm o proteína).
Una vez que el ARN guía se une a la secuencia diana, la enzima cas9 reconoce el sitio y produce una ruptura de doble cadena en la secuencia de ADN justo antes de la secuencia PAM. Esto da como resultado INDELS (inserciones / eliminaciones). ASÍ QUE la secuencia no es la misma después de la ruptura, lo que da como resultado la pérdida completa de la función del gen (knockout).
Esto ocurre mediante recombinación homóloga o unión final no homóloga durante el ciclo celular para reparar el daño.
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