¿Cuál es la diferencia entre CRISPR y las enzimas de restricción?

Una enzima de restricción reconoce una secuencia específica (exclusiva de cada enzima) y realiza un corte. Por ejemplo, EcoRI reconoce la secuencia de nucleótidos GAATTC y la corta de modo que se convierta en dos fragmentos con voladizos como se muestra en la siguiente imagen


Tenga en cuenta que no se elimina / agrega ningún nucleótido. Si la secuencia está religada, nuevamente es la misma secuencia.
Para la digestión de restricción, todo lo que necesita es un ADN, una enzima y condiciones de tampón específicas.

Sin embargo, las cosas son un poco complicadas en CRISPR / Cas9. Aquí puede elegir cualquier sitio en el ADN siempre que se cumplan algunos criterios como una secuencia PAM (requerida para el reconocimiento de Cas9, nGG, n = cualquier nucleótido).


así es como va
1) elige un sitio de destino
2) diseñar un ARN guía polinucleotídico que contenga bases complementarias de su sitio diana (la parte del ARN guía que se une al ADN diana) y el resto de la secuencia se requiere para un plegamiento conformacional adecuado para el reconocimiento por la enzima Cas9 (burbuja azul).
3) Inyectar los embriones / tratar las células (yo trabajo con embriones de rana) con a. guía RNA, b. Enzima Cas9 (ya sea ARNm o proteína).

Una vez que el ARN guía se une a la secuencia diana, la enzima cas9 reconoce el sitio y produce una ruptura de doble cadena en la secuencia de ADN justo antes de la secuencia PAM. Esto da como resultado INDELS (inserciones / eliminaciones). ASÍ QUE la secuencia no es la misma después de la ruptura, lo que da como resultado la pérdida completa de la función del gen (knockout).

Esto ocurre mediante recombinación homóloga o unión final no homóloga durante el ciclo celular para reparar el daño.

Distribución más simple

Que te diviertas.

Ambas enzimas de restricción y Cas9 (parte del sistema CRISPR) son endonucleasas, lo que significa que cortan el ADN en algún lugar en el medio de un filamento, en lugar de quitar las bases del extremo. La diferencia funcional principal está en el mecanismo por el cual reconocen la secuencia que se supone que cortan.

La diferencia más importante es que, para las enzimas de restricción, el sitio de corte está “cableado” en la estructura de la proteína. Una enzima de restricción dada solo puede cortar en un sitio particular. Para hacer una enzima de restricción que reconozca un sitio nuevo, sería necesario diseñar una proteína completamente nueva. Desafortunadamente, no sabemos lo suficiente en general sobre cómo se doblan las proteínas para diseñar eficientemente nuevas enzimas.

Por otro lado, Cas9 es guiado a su sitio de corte por un único ARN guía (ARNg) que se dirige exclusivamente a la secuencia de ADN a la que es complementario. Esto significa que en lugar de diseñar una proteína completamente nueva, si queremos enfocarnos en un sitio específico, simplemente podemos cambiar la secuencia de ARNg, las técnicas que han sido prácticas comunes durante las últimas décadas.

Hay otras peculiaridades en cada sistema, pero esa es la diferencia fundamental entre los dos, y por qué CRISPR ha causado un gran revuelo. Antiguamente era extremadamente difícil cortar ADN en una secuencia específica. Las enzimas de restricción nunca fueron realmente una opción viable para esto, pero se desarrollaron técnicas para diseñar endonucleasas específicas (TALEN y ZFN). Sin embargo, requirieron mucho tiempo y dinero. Con CRISPR, lleva unos días.

EDITAR: Olvidé mencionar que los ZFN y los TALEN (mencionados anteriormente) a menudo hacen uso del dominio de corte no específico de FokI, que es una enzima de restricción. Sin embargo, el dominio de reconocimiento de ADN no se basa en enzimas de restricción.

Agregando a la respuesta de Sudhakar, Cas9 también se puede utilizar para los siguientes propósitos:

1. Reemplazo de genes, ya que las roturas de doble cadena que produce pueden inducir la recombinación con un trozo de ADN homólogo (pero no necesariamente idéntico) introducido por el experimentador.

2. Activación o inhibición de la transcripción de cualquier gen, especificado por su unión al ARN guía, si una versión catalíticamente inactiva se fusiona con un activador o represor.

Buena pregunta pero bastante simple de responder. las enzimas de restricción tienen una función global en un fragmento de ADN, cortarán ese filamento en sitios específicos, donde sea y con la frecuencia que lo encuentren. Entonces, aunque se pueden definir los sitios en los que ocurrirá, el proceso de corte es incontrolable.

Por otro lado, CRISPR es exquisitamente controlable ya que está guiado por una pieza única de ARN, por lo que solo cortará donde encuentre esa secuencia. ¡Ha sido posible utilizar este sistema no solo para cortar un único par de bases, sino para reemplazarlo por otro!