¿Cómo funciona MutS ‘escanea’ el ADN en su estado inactivado sin el uso de ATP?

Una breve introducción para MutS:

MutS es una proteína de unión al ADN extremadamente bien conservada que está implicada en el reconocimiento del desajuste del ADN. En procariotas, la proteína MutS forma un homodímero que se desliza a lo largo del ADN para identificar mutaciones de base única así como pequeñas inserciones / deleciones. Los homólogos eucarióticos MutS forman dos complejos, MutSα para el reconocimiento de las sustituciones de bases, y MutSβ para la identificación de inserciones de bucle pequeñas a grandes (~ 10 bases). MutS también tiene un dominio ATPasa (fuera del sitio de unión al ADN) que permite el intercambio ATP / ADP, y el estado de MutS unido a nucleótidos determina en gran medida sus funciones.

Estructura cristalina del complejo TAQ MutS-DNA. Las dos subunidades de proteínas están representadas por diagramas de cinta en azul (A) y verde (B). El ADN se muestra en un modelo de relleno de espacio, en el que los átomos de la estructura son rojos y las bases son rosadas. Se muestran tres vistas ortogonales desde el lateral, frontal y superior.

Fuente: estructuras cristalinas de la proteína de reparación de desapareamientos MutS y su complejo con un ADN de sustrato

Aunque el MutS procariótico forma un homodímero, de hecho es un heterodímero estructural. Esto se debe a que al unirse al ADN no coincidente, solo uno de los monómeros en el complejo sufre un cambio conformacional e inserta un residuo de fenilalanina en la cadena principal del ADN para introducir una deformación o acodadmiento en el ADN:

Desajuste reconocimiento por MutS: (a ) Los dominios de unión a ADN representados por diagramas de cinta se muestran con el ADN heterodúplex. Los dominios I y IV de la subunidad A se muestran en azul oscuro y naranja; los dominios correspondientes de la subunidad B están en azul claro y amarillo. Las cadenas principales de ADN fosfato están representadas por cintas rojas y los azúcares y las bases se muestran como bolas y bastones. Phe 39 de la subunidad A se muestra en amarillo. Los elementos estructurales de la subunidad B se denotan con un primo. (e ) Un diagrama de las interacciones proteína-ADN. Solo se muestran los pares de bases que entran en contacto con MutS. Los grupos fosfato están representados por óvalos entre los pentágonos de azúcar. Las interacciones realizadas por cada dominio de proteína se marcan con el mismo color que el diagrama de cinta de este dominio en a . Los enlaces de hidrógeno están representados por flechas rojas y contactos de van der Waals por flechas azules.

Fuente: estructuras cristalinas de la proteína de reparación de desapareamientos MutS y su complejo con un ADN de sustrato

Hay dos preguntas que deben considerarse para comprender el mecanismo de escaneo MutS:

1. ¿Cómo MutS “escanea” el ADN en busca de mutaciones?
2. ¿Cómo juegan los estados unidos a nucleótidos (ATP o ADP) de MutS un papel en el reconocimiento y la reparación de los desajustes?

Se han realizado muchos estudios para determinar el mecanismo exacto por el cual MutS identifica los desajustes de bases en un filamento de ADN. Mediante el uso de varios métodos biofísicos, como FRET de una sola molécula o el movimiento de MutS en cortinas de ADN, los investigadores han establecido que MutS identifica mutaciones mediante una combinación de dos mecanismos:

1. Por difusión 3D al azar, y
2. Por 1D difusión helicoidal a lo largo de la cadena de ADN.

Fuente de la imagen: la obtención de imágenes de una sola molécula revela mecanismos de búsqueda de objetivos durante la reparación del desajuste del ADN

La mayoría de MutS libres o unidos a ADN existe en un estado vinculado a ADP, y el proceso de escaneo unidimensional para MutS parece ser dependiente de ATP, ya que puede ocurrir en ausencia de ATP. Al encontrar una falta de coincidencia o inserción de bases, MutS se para en ese lugar insertando un residuo de fenilalanina entre las bases mutadas.

MutS permanece estancado en la ubicación no coincidente hasta que el ADP se reemplaza por ATP en su sitio de unión a nucleótidos. Después de este intercambio, MutS se libera de la ubicación no coincidente, y se difunde hacia arriba y hacia abajo de la cadena de ADN en una forma 1D no rotativa , hasta que encuentra algunas máquinas de reparación de ADN.

MutL es otra proteína implicada en la vía de reparación del desajuste del ADN, y solo se puede unir a MutS que se ha estancado al reconocer el desajuste. MutL ayuda a aumentar la huella del complejo MutS / MutL, lo que facilita una reparación más rápida del ADN.

Lo anterior es una versión bastante simplificada de los efectos de ATP / ADP en el reconocimiento de desajuste MutS. Para una descripción más detallada, recomendaría pasar por el siguiente mecanismo:

Descripción general de los estados de ADN y nucleótidos observados de E. coli MutS en el análisis nativo de MS y modelo de activación inducida por ATP en ADN mal emparejado. Se representan todos los estados de nucleótidos MutS de E. coli diméricos que se observan directamente en nuestro ensayo de MS, con la excepción del estado IIf, que es la pinza deslizante MutS que se difundirá desde el ADN lineal antes de la detección. Los estados representados se pueden considerar como dímeros aislados, o como dímeros dentro del tetrámero MutS, porque la asimetría de nucleótidos está regulada en el nivel del dímero. La mitad superior de la figura muestra los estados en ausencia de ADN, la mitad inferior muestra los estados en presencia de ADN. Los nucleótidos que se unen ay se liberan de MutS se indican con bolas azules (ADP) y bolas rojas (ATP / AMP.PNP). Las subunidades A y B dentro del dímero MutS no se pueden distinguir en nuestro ensayo, por lo tanto, los nucleótidos se dibujan en la interfaz entre las subunidades. El tamaño de las flechas es una indicación de la velocidad del paso de reacción. Se han dado pasos muy rápidos antes de la detección en nuestro ensayo MS, se pueden observar pasos rápidos como ocupación parcial, y no se observan pasos muy lentos en nuestro ensayo. La activación de MutS ocurre a través de la ruta Ic-Ib-Id-IId-IIe-IIf si la proteína encuentra ATP antes de un desajuste de ADN. La activación de MutS ocurre a través de la ruta Ic-IIc-IIb-IId (o IIa) -IIe-IIf si la proteína encuentra la falta de coincidencia de ADN en el estado de ADP. En ambos casos, la formación de un estado unido a ADN incompatible relativamente estable que contiene un único ATP (estado IIe) es crucial. Este es el único estado unido a AMP.PNP en el ADN que observamos con gran abundancia en nuestro análisis de EM. Es este estado el que verifica que MutS está realmente ligado a un desajuste de ADN. La posterior unión de ATP por la subunidad B da como resultado un estado de ATP doble que experimenta un cambio conformacional en el que los dominios de unión de desapareamiento se separan y la proteína forma una pinza deslizante que reclutará MutL e iniciará la reparación.

De: La espectrometría de masas nativa proporciona evidencia directa para la regulación inducida por desajuste de ADN de la unión asimétrica de nucleótidos en la proteína de reparación de desapareamientos MutS

Fuentes:

• La estructura cristalina de la proteína de reparación del desajuste de ADN MutS se une a un desajuste de GT
• Mecanismo de reconocimiento de desajuste revelado por MutSβ humano unido a bucles de ADN no apareados
• MutS cambió entre dos abrazaderas fundamentalmente distintas durante la reparación del desajuste
• Estructuras de la enzima de reparación del desajuste del ADN de Escherichia coli MutS en complejo con diferentes desapareamientos: un modo de reconocimiento común para diversos sustratos
• Visualizar el movimiento de la proteína en el ADN a nivel de una sola molécula usando cortinas de ADN
• La obtención de imágenes de una sola molécula revela mecanismos de búsqueda de objetivos durante la reparación del desajuste del ADN
• Mecanismos y funciones de la reparación del desajuste del ADN
• Vistas de una sola molécula de MutS en ADN no coincidente
• El sistema de reparación de desajuste multifacético
• La espectrometría de masas nativa proporciona evidencia directa de la regulación inducida por desajuste de ADN de la unión asimétrica de nucleótidos en la proteína de reparación de desapareamientos MutS

Gracias David Li por el A2A; esta fue una pregunta realmente interesante!