¿Cuáles son las ventajas y limitaciones de usar Western-blot vs. ELISA vs. citometría de flujo?

Creo que esta es una pregunta difícil de responder sin escribir un ensayo completo, pero traté de describir las principales diferencias de una manera un tanto simplificada:

Western blot y ELISA proporcionan formas de cuantificar la cantidad de proteína en lisados ​​de células (o tejidos) basándose en su unión a un anticuerpo primario. La principal diferencia es que Western Blot proporciona la separación de proteínas en función del tamaño. De esta forma, las proteínas pueden cuantificarse incluso si el anticuerpo primario tiene unión no específica a otros epítopos (lo que da como resultado bandas correspondientes a otros pesos moleculares). La desventaja es que el método lleva mucho tiempo y es un poco difícil de dominar. ELISA, por otro lado, es rápido y fácil pero no muy útil a menos que el anticuerpo primario sea realmente específico.

La citometría de flujo es una bestia diferente. Este método mide las células intactas basándose en sus capacidades de dispersión de la luz (una especie de medida indirecta de tamaño y granularidad citoplásmica) y, por lo general, en varios canales de fluorescencia. La fluorescencia puede ser proporcionada por proteínas fluorescentes producidas por la célula o por anticuerpos secundarios fluorescentes que se unen a anticuerpos primarios en la superficie celular. El primero se usa típicamente para medir, por ejemplo, GFP introducido como un gen reportero como parte de un vector genético (la citometría de flujo puede usarse para identificar las células que han tomado el vector) y el último se usa para identificar células que tienen una cierta proteína en la superficie de la célula. Dado que las células están vivas e intactas durante todo el proceso, la citometría de flujo también se puede usar para la clasificación, de modo que las células positivas para algún marcador de superficie puedan desviarse a un contenedor separado y luego cultivarse por separado. La desventaja es que la proteína de interés debe estar presente en el exterior de la célula, de lo contrario, el anticuerpo primario no se unirá a ella.

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Primero, analicemos la definición de Western Blot, ELISA y citometría de flujo en un lenguaje simple. Siempre puede seguir el enlace para obtener información más detallada sobre estos ensayos / métodos.

El ELISA o el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas es útil para identificar una sustancia usando anticuerpos y cambios de color. Encuentre el protocolo y la explicación detallada sobre ELISA en mybiosource learning center .

Western Blot se usa para separar e identificar proteínas. Mediante la electroforesis en gel, las proteínas se separan en función del peso molecular. Encuentre el protocolo y la explicación detallada sobre el western blot en el Centro de aprendizaje mybiosource .

La citometría de flujo es útil para analizar las propiedades físicas y químicas de las partículas. En la investigación biológica, los componentes celulares son etiquetados fluorescentemente y luego son excitados por un rayo láser para emitir luz a diferentes longitudes de onda. La granularidad relativa, el tamaño, la intensidad de fluorescencia y la complejidad interna se estudian principalmente mediante citometría de flujo. Encuentre el protocolo y la explicación detallada de la citometría de flujo en el Centro de aprendizaje mybiosource .

Ventajas y limitaciones de ELISA, Western Blot y citometría de flujo.

  1. La sensibilidad y especificidad de ELISA es del 98%.
  2. La sensibilidad y especificidad de Western blot / citometría de flujo es del 100%.
  3. Ejecutar ELISA es más barato en comparación con Western Blot y citometría de flujo.
  4. La transferencia Western consume mucho tiempo debido a procedimientos largos y tediosos, es decir, de 6 a 16 horas.
  5. Se dedica una gran cantidad de tiempo al procesamiento de la transferencia Western para su detección.
  6. La calidad del anticuerpo / antígeno es importante tanto para ELISA como para Western Blot.
  7. Los kits de ELISA están disponibles para proteínas / sustancias diana bien conocidas.
  8. Los factores que afectan los resultados de Western Blot incluyen el método de transferencia, el tipo de membrana utilizada, el tampón de bloqueo, los reactivos y las técnicas de sondeo.
  9. La citometría de flujo requiere la gestión de un especialista altamente capacitado y el mantenimiento continuo de los ingenieros de servicio, ya que los instrumentos complejos son propensos a bloqueos del sistema de microfluidos además de la limpieza y la calibración del láser.
  10. Las ventajas de la citometría de flujo incluyen un análisis de alta velocidad según la velocidad de flujo, mide un solo y gran número de células, mide múltiples parámetros, cuantifica la intensidad de fluorescencia, clasifica la población de células predefinida, además de identificar poblaciones pequeñas.
Samuel Kvarnbrink

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