¿Cuáles son los errores más comunes (evitables) en la PCR?

A continuación se presentan algunos desafíos / errores que se encuentran con frecuencia al configurar una PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) Intenté enumerarlos en el orden en que podrían aparecer en un flujo de trabajo de expresión génica. Espero que ayude.

1. ARN de mala calidad : los ARN son extremadamente sensibles a la degradación por RNasas. Aunque la qPCR tolera la degradación parcial, puede no proporcionar una representación precisa de la expresión génica.
Solución:

• Selección de un método de extracción apropiado que pueda asegurar un alto rendimiento y pureza de ácido nucleico y una eliminación completa de los inhibidores de la PCR.
• Almacenamiento y manejo adecuados de las muestras de las cuales se extraerá el ARN
• Descontaminación del banco de laboratorio, pipetas y guantes con solución de desactivación de ARNasa
• Almacenamiento de ARN extraído en solución libre de RNasa
• Evaluación de la integridad del ARN mediante un bioanalizador o una electroforesis en gel de agarosa que miden la relación de masa del rRNA 28s y 18s. Una relación menor a 2: 1 indica degradación.

2. Proporciones de 260/280 o 260/230 más bajas : estas proporciones son una medida de la pureza del ARN. La relación de 260/280 en el rango de 1.8-2.0 y 260/230 en el rango de 2.0-2.2 generalmente se acepta como pura. Cualquier cosa más baja puede indicar la presencia de proteínas, fenol u otros contaminantes que se absorben fuertemente cerca de estas longitudes de onda.
Solución:

• Si se utiliza un método de extracción basado en columnas, los pasos de lavado antes de eluir el ARN son muy críticos. A menudo es útil invertir los tubos suavemente después de agregar la solución de lavado al tubo y antes de la centrifugación. Esto debería cubrir eficazmente las paredes y la parte superior del tubo donde podrían estar los contaminantes potenciales que luego pueden ser derribados durante la centrifugación.
• Si las proporciones son aún más bajas después de la extracción, una precipitación con etanol debería eliminar de manera efectiva las sales residuales.

3. Contaminación del ADN genómico: es imposible eliminar completamente el ADN genómico incluso cuando se realiza un tratamiento con ADNasa durante la extracción.
Solución:

• El uso de un control “-RT” indica la presencia de ADN genómico contaminante si hay una amplificación.
• Una forma más efectiva es diseñar un cebador que abarque al menos una unión exón-exón en el ARNm diana para evitar que la amplificación del objetivo contamine el ADN genómico.
• La contaminación cruzada de cualquier reactivo con el amplicón se puede detectar ejecutando un control sin plantilla (todos los reactivos excepto el ARN). Cualquier amplificación indica que uno o más reactivos de PCR están contaminados.

4. La transcripción inversa (RT) puede no ser óptima: un rendimiento deficiente de una reacción de RT a su vez daría como resultado un rendimiento deficiente de una reacción de PCR. Las razones principales incluyen: Cantidad incorrecta de ARN para el tamaño de la reacción de RT, presencia de inhibidores de RT en el ARN. La información detallada de la solución de problemas de este paso se puede encontrar aquí. Su transcripción inversa puede no ser óptima

5. Diseño pobre de la imprimación y de la sonda: Cuando se diseñan cebadores, es importante tener en cuenta parámetros como la temperatura de fusión (Tm), la complementariedad y la estructura secundaria, así como el tamaño del amplicón y otros factores importantes. Existen varias herramientas de diseño de cebadores en línea que consideran estos factores permitiendo el diseño de cebadores más eficiente.

6. Variabilidad: Como la PCR es una reacción de amplificación, incluso un error mínimo se amplifica junto con la reacción. Por lo tanto, es importante mantener la variabilidad al mínimo.
Solución:

• Cuantificación precisa de la cantidad inicial de ARN
• Usar una mezcla maestra para todos los reactivos cuando se usan reacciones múltiples para minimizar la variabilidad entre reacciones repetidas y entre muestras.
• Incluye un colorante pasivo de referencia en la reacción que se normaliza para errores de pipeteo, variaciones ópticas de pozo a pozo en el instrumento y cambios en la concentración o el volumen de la mezcla de reacción durante la ejecución de qPCR.

7. Control endógeno: se usa un control endógeno para normalizar las diferencias en la cantidad de ADNc cargado en las reacciones. Por lo tanto, los niveles de expresión de un buen control endógeno no deberían variar entre las muestras analizadas. También es crítico determinar si el tratamiento o la intervención afectan el nivel de expresión del gen o genes de control endógeno candidato en un estudio .

8. No hay suficiente secuencia de plantillas: a veces, un gen de interés puede tener una expresión muy baja en un tipo de muestra. Además, algunos tipos de muestra producen ácido nucleico muy bajo durante la extracción.
Solución:

• Secuencias diana de preamplificación.

• Aumentando la cantidad de plantilla utilizada en la reacción.
• Seleccionar un kit que maximice el rendimiento para un tipo de muestra dado.

9. Variantes de empalme: si un cebador no puede detectar todas las variantes de empalme alternativo de un gen de interés, la amplificación se verá en ciclos posteriores a los esperados.
Solución:

• Diseñando un Primer que contiene la secuencia común a todas las variantes de empalme alternativo.

10. Línea de base y umbral: para obtener valores de Ct precisos, la línea de base necesita establecerse dos ciclos antes que el valor de Ct para la muestra más abundante. Para que los datos de qRT-PCR en tiempo real sean significativos, el umbral debe establecerse cuando el producto está en fase exponencial. Por lo general, esto se establece al menos a 10 desviaciones estándar de la línea de base.

El sitio web de Life Technologies tiene una gran cantidad de información técnica sobre qPCR que me parece muy útil. He utilizado la información de su sitio web (Top Ten de las trampas de qRT-PCR en tiempo real más comunes) como referencia para proporcionar esta respuesta.