Lo primero que haría sería preparar nuevamente todos los reactivos (antibióticos e IPTG). Tampoco use un caldo de glicerol almacenado o un plato viejo para comenzar su cultivo. Recién transforma el nuevo BL21 con el plásmido de expresión y utiliza células de la nueva placa para comenzar tu cultivo. La mayoría de los males en la expresión de proteínas surgen de reactivos o células que se dañaron con el almacenamiento. No vale la pena el tiempo para solucionarlo y, a menudo, son lo suficientemente baratos como para volcar y comenzar de cero. Si este problema es específico para usted, (es decir, otros miembros mayores del laboratorio pueden producir la proteína mientras que usted no puede hacerlo), los reactivos y las células serían el principal sospechoso.
Si la idea es obtener proteínas más expresadas, puede tratar de cultivar más células. Puede tratar de expresar la proteína en Terrific Broth. El caldo excelente se puede cultivar a densidades ópticas muy altas porque es más rico que LB y también se tampona. Tal vez esto te dará más rendimiento que en LB.
Sin embargo, si se trata de una proteína que se está expresando por primera vez (suponiendo que no haya deficiencias en la técnica y la calidad de los reactivos), es posible utilizar otros métodos.
Para la solución de problemas, haga crecer sus celdas en su medio de expresión y mida la densidad óptica periódicamente (una vez cada 30 min para E coli a 37 C). Después de la inducción de la expresión de proteínas usando IPTG, ¿la densidad óptica sigue aumentando, o se estabiliza? Si el crecimiento celular se detiene después de la inducción, podría deberse a que la proteína que está tratando de expresar es tóxica. Si este es el caso, existen cepas resistentes a la toxicidad como C41 (DE3) o C43 (DE3) (OverExpress C41 (DE3) y C43 (DE3) Competent Cells).
Si la proteína no es tóxica (las células están creciendo bien) pero el rendimiento sigue siendo bajo, considere lo siguiente.
Si la proteína que está tratando de expresar es de un organismo heterólogo (es decir, si está intentando expresar una proteína eucariótica en E. coli), entonces es posible que la distribución del codón en su gen no sea óptima para la expresión en E. coli. El uso de una cepa diseñada como Rosetta 2 (DE3) posiblemente podría aumentar el rendimiento (https://www.emdmillipore.com/US/…)
Para algunas proteínas, el rendimiento de proteína soluble aumenta al disminuir la temperatura de inducción. Un protocolo para hacer esto es cultivar 4L de células en LB + antibiótico a 37ºC. Las células se recolectan en una botella de centrífuga estéril (esterilizada en autoclave) y se resuspenden en 1L LB + antibiótico a 16ºC. Después de 1 hora, las células se inducen con IPTG. La expresión de proteína se puede hacer durante 16-24 horas.
