Si usa una concentración más alta de la misma enzima conjugada, ¿esperaría ver los mismos resultados en un ELISA?

Supongo que por enzima conjugada se quiere decir el conjugado de anticuerpo primario (en ELISA directo) o el conjugado de anticuerpo secundario (en ELISA indirecto).

Si aumenta la concentración del conjugado de anticuerpos, observará un aumento en las lecturas de absorbancia , aunque no sea de su beneficio.

El aumento en las lecturas de absorbancia proviene del aumento de la unión inespecífica de los anticuerpos conjugados a otros sitios de unión no diana. Como tal, observará un fondo más alto (ruido) en todos los pozos, lo que dará lugar a una relación señal / ruido más alta y una mayor inexactitud de las mediciones.

Hola..

Según los parámetros dados, la concentración de antígeno es la misma. Y estamos tratando de cuantificar estos antígenos por medio de la interacción proteína-proteína (antígeno, antisueros, anticuerpos, enzimas, todos son proteínas. ¿Verdad?)

Para el propósito de la detección, usamos la enzima (los antígenos se unen primero a la enzima, peroxidasa de rábano picante , por ejemplo) y luego la adición de un segundo sustrato permite la detección).

Por lo tanto, una mayor cantidad de enzima no puede alterar nada, ya que el número de antígenos es fijo, es decir, un número limitado de antígenos se unirá a un número limitado de enzimas. La aplicación de una mayor concentración enzimática aumentada (más cantidad de moléculas de enzima por volumen) no será de mucha utilidad debido al hecho de que los antígenos ya están saturados con enzimas y ya no quedan más anticuerpos para que se una el exceso de moléculas de enzima; un fenómeno, denominado Efecto de Saturación .

Y después del lavado, este mayor número de moléculas de enzimas libres se eliminará por lavado. Y después de la adición del segundo sustrato, obtendremos el mismo resultado.

Y para el registro, la aplicación del exceso de enzima da una curva hiperbólica ( n . ° de enzimas utilizadas frente a la gráfica de absorbancia ) debido a este efecto de saturación.

Fuente de la imagen: Google. Gracias.

Editar: el aumento en la absorbancia puede encontrarse solo debido a una unión no específica, lo que lleva a una interpretación engañosa. Gracias

Nop. En un Elisa, si ya ha diluido su muestra a un rango detectable, aumentar la enzima conjugada no causará un aumento en la absorbancia. Esto se debe a que el factor limitante en un ELISA es el antígeno de interés.

Si hace esta pregunta, una deducción lógica, si me lo permite, es que no está obteniendo resultados o resultados que no son lo suficientemente altos para una lectura. Si es así, repita el ELISA con diferente concentración de la muestra que desea probar y realice una dilución en serie. Para su caso, le sugiero usar un control positivo SI tiene uno y también incluirlo en una muestra no diluida (nítida) para asegurarse de que obtiene el rango completo de lectura.

Si aún no obtiene una lectura pero está muy seguro de que el antígeno que está analizando está allí, es posible que necesite aumentar el número de células / aumentar la concentración del fármaco para inducir más secreción / liberación del antígeno de interés en su sobrenadante para poder para obtener una lectura detectable.

Un último esfuerzo es usar otro método de detección que sea más sensible que ELISA para la detección.