Dado que la cuantificación precisa de proteínas es esencial para todos los experimentos relacionados con los estudios de proteínas, se han desarrollado diferentes métodos para medir la concentración de proteínas en un ensayo dado. Algunos de los métodos más tradicionales de cuantificación de proteína total incluyen la medición de la absorbancia UV a 280 nm (A
280
), Ácido bicinconínico (BCA) y ensayos de Bradford, y otros métodos alternativos como Lowry y otros ensayos novedosos.
Dado que las proteínas absorben la luz a una longitud de onda específica, la medición se puede obtener utilizando un espectrofotómetro. Específicamente, los aminoácidos tirosina y triptófano tienen una absorción muy específica a 280 nm, permitiendo la medición directa de A280 de la concentración de proteína.
La absorbancia UV a 280 nm se usa de forma rutinaria para estimar la concentración de proteínas en los laboratorios debido a su simplicidad, facilidad de uso y asequibilidad. Las mediciones son rápidas y altamente reproducibles ya que no hay necesidad de incubación. Además, este método también requiere un volumen de muestra extremadamente pequeño ya que los espectrofotómetros modernos usan un sistema de retención de muestra durante la medición.
Sin embargo, se debe tener cuidado para asegurar que la muestra de proteína no contenga ningún componente no proteico (por ejemplo, ácidos nucleicos) con el mismo espectro de absorción ya que puede conducir a resultados erróneos. Además de determinar las concentraciones de proteínas, los valores de absorbancia también se pueden usar para detectar cambios conformacionales y unión de ligandos y para seguir reacciones enzimáticas.
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El efecto del triptófano y la tirosina en la cuantificación de proteínas
Debido a la presencia de tirosina y triptófano, las proteínas y péptidos que contienen estos aminoácidos aromáticos absorben la luz ultravioleta a una longitud de onda de 280 nm. Cada uno de estos residuos tiene distintas longitudes de onda de absorción y emisión y varía en rendimientos cuánticos. Los enlaces de fenilalanina y disulfuro también contribuyen en la absorción a esta longitud de onda, pero dado que es relativamente insignificante, solo pueden observarse en ausencia de triptófano y tirosina.
Muchos cofactores enzimáticos que contienen estructuras de anillos aromáticos (por ejemplo, FMN, FAD, NAD y porfirinas) también absorben la luz UV para la excitación y, por lo tanto, aumentan la intensidad de la fluorescencia resultante. Las proteínas especiales tales como la proteína verde fluorescente también tienen una secuencia interna de serinetyrosine-glicina que se modifica postraduccionalmente y es fluorescente en la región de luz visible.
Triptófano
El triptófano es significativamente más fluorescente que la tirosina y la fenilalanina. Sin embargo, sus propiedades fluorescentes dependen del disolvente, es decir, el espectro se desplaza a longitudes de onda más cortas y aumenta en intensidad a medida que disminuye la polaridad del disolvente. Como tal, los residuos de triptófano enterrados en dominios hidrófobos de proteínas plegadas exhiben un desplazamiento espectral de 10 a 20 nm.
Debido a su mayor capacidad de absorción, mayor rendimiento cuántico y transferencia de energía de resonancia, el espectro de fluorescencia de una proteína que contiene los tres aminoácidos generalmente se parece al del triptófano.
Tirosina
La tirosina se puede excitar a longitudes de onda similares a la del triptófano, pero se emitirá a una longitud de onda distintivamente diferente. Si bien puede ser cierto que la tirosina es menos fluorescente que el triptófano, puede proporcionar una señal importante, ya que a menudo está presente en grandes cantidades en muchas proteínas. Se ha observado que la fluorescencia de la tirosina se apaga por la presencia de restos de triptófano cercanos, ya sea a través de la transferencia de energía de resonancia o la ionización de su grupo hidroxilo aromático.
Aquí hay algunos puntos importantes para recordar cuando se miden péptidos usando el A
280
método.
- Las proteínas de peso molecular similar pueden tener diferentes valores de absorbancia debido a la diferencia en el contenido de triptófano y tirosina.
- La absorbancia UV también se ve afectada por la estructura de la proteína. Por lo tanto, las condiciones que afectan la estructura (como temperatura, pH, fuerza iónica o presencia de detergentes) pueden afectar la capacidad de los residuos aromáticos para absorber luz a 280 nm y cambiar el valor del coeficiente de extinción de la proteína.
- El entorno local de los aminoácidos aromáticos puede tener un efecto sobre sus espectros. Esto significa que el triptófano tendrá un pico de emisión a longitudes de onda más bajas cuando esté enterrado dentro de las regiones hidrofóbicas internas de una proteína, mientras que la tirosina a menudo transferirá su energía a los triptófanos aminoácidos adyacentes. El tirosinato ionizado, que se forma cuando los protones se pierden de la tirosina como resultado del aumento del pH, demostrará longitudes de onda similares al triptófano.
