Este es un problema de varios pasos, y los pasos son más o menos así, si tus pigmentos son moléculas orgánicas :
- Exprima (extraiga) muestras de material de interés en varios solventes y condiciones de temperatura hasta que retire con éxito el pigmento y lo recolecte en su solvente.
- Si su (s) pigmento (s) está (n) secuestrado (s) en estructuras duraderas, es posible que tenga que interrumpir mecánicamente su material para lograr esto. Si sus pigmentos no son solubles en algo útil, tendrá que descubrir cómo descomponerlos en componentes que son solubles, y además descubrir cómo la masa de componentes reunida se relaciona con la molécula original.
- Ubique su extracto en varias placas de TLC y pruebe una variedad de sistemas de solventes hasta que logre una separación que aísle su molécula coloreada.
- Esperamos que su sistema de solvente sea compatible con la instrumentación de separaciones de alta presión y se configure con una columna y un sistema de solventes apropiados para replicar las condiciones iniciales de la cromatografía. Verifique que vea el mismo número de picos principales que vio puntos grandes en su placa TLC, e identifique el pico asociado con su colorante
- Si tiene suerte y está bien provisto de dinero en efectivo, puede ampliar su separación exitosa a lo que en el negocio llamamos “escala de preparación”, que implica repetir los pasos 1 a 3 en una escala de varios gramos. En lugar de simplemente recolectar su espectro, estará recolectando cientos de contenedores de extractos solventes y analizando el contenido de cada uno. Combine los extractos que contienen solo su pigmento, y concéntrelos al vacío (como en un evaporador rotatorio).
- Una vez que tiene su extracto de pigmento concentrado, necesita averiguar exactamente qué es. Esto probablemente implicará al menos RMN de protón, al menos una variedad de análisis espectrométrico de masas, análisis elemental, y tal vez RMN de carbono y / o RMN 2D con el fin de descubrir la estructura molecular. Cruce los dedos y espere que sea algo ya conocido y disponible comercialmente, porque comprar una botella para análisis posterior es mucho más barato y más fácil que extraer más.
- Ahora que (con suerte) conoce la estructura molecular y el peso molecular de su colorante, puede preparar una serie de diluciones en un disolvente apropiado con concentraciones molares conocidas. Mida la absorbancia UV-Vis de sus soluciones a una longitud de onda de luz adecuada. Esto le proporcionará tanto el coeficiente de extinción de su colorante (una medida de su intensidad como está preparado) como una curva de calibración, que puede usar para determinar la concentración de soluciones posteriores de su colorante.
- De acuerdo, hasta ahora hemos pasado varias semanas o meses aislando e identificando y analizando nuestro único colorante objetivo. Hemos utilizado varios cientos de miles de dólares en equipo para hacerlo. Ahora debe volver al paso 1 y extraer la cantidad total de colorante en su unidad preferida de muestra (1 huevo, 1 oz de material vegetal, 50 flores, lo que sea). Usando una combinación de análisis gravimétrico, densidades y su curva de calibración desde el paso 6, puede volver a calcular la masa de colorante obtenida de su muestra.
En otras palabras, cuantificar un componente no identificado en una muestra biológica es una tarea bastante costosa. No es algo que haces solo para reír. Puede hacer una versión rápida y sucia que deja fuera los pasos 2 a 5, pero eso le da resultados que son más relativos que absolutos.
Si sus pigmentos son inorgánicos, estoy menos seguro de cómo se realizaría el análisis antes de llegar al paso 6, pero puedo analizarlo si tiene un pigmento específico de interés.
