La enzima de restricción es como un cuchillo para cortar el ADN. Pero no puedes cortar el ADN en cualquier posición que desees. La enzima de restricción (RE) tiene una secuencia específica que puede reconocer (llamada secuencia de reconocimiento). Por lo tanto, puede cortar en secuencia de reconocimiento (o cerca) dependiendo del tipo de RE que use. Leer: Tipos de enzimas de restricción
Aquí es cómo Eco RI y SmaI cortan el gen
Tenga en cuenta que el sitio de reconocimiento suele ser palindrómico.
Hay muchas enzimas de restricción que se han descubierto. Y algunos ejemplos se enumeran en la tabla aquí: enzima de restricción
Aquí hay un ejemplo de la enzima de restricción HindIII
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Si compra un plásmido, obtendrá la siguiente información como se presenta a continuación. Entonces, para insertar genes, solo puedes cortar e insertar genes en el sitio de restricción. Para obtener más información sobre sitios de restricción para pBR322, consulte la referencia [3]
Hay una lista de plásmidos que puedes consultar aquí: Categoría: Plásmidos – EcoliWiki
Pero también tenga en cuenta que la secuencia de genes que desea insertar también debe tener la misma secuencia de reconocimiento o enlazador. (Para combinar el gen con el plásmido, usa ADN ligasa)
Además, cuando cortas el plásmido, terminarás con tres posibilidades de los fragmentos. Digamos que un plásmido tiene 2 EcoRI, y si lo cortas, descubrirás que terminarás con tres fragmentos (necesitas usar electroforesis en gel (como PAGE) para hacer esto). Los tres fragmentos (ver Fig. 2 ) son; 1) un fragmento sin cortar, 2) el fragmento grande (2870 bps) y 3) el fragmento pequeño (1200 bps). (Aunque no estoy seguro de si es posible si solo se corta un sitio de restricción en lugar de dos). También pueden ocurrir eventos similares cuando se combina el gen de interés en el plásmido (es decir, formará varios fragmentos diferentes).
Figura 2
El protocolo para usar la enzima de restricción está disponible aquí: Cómo llevar a cabo una Restricción Digest
Aunque la descripción anterior es bastante simple. La aplicación real es un poco más difícil.
No estoy del todo seguro de todos los factores que lo dificultan. Pero daré un ejemplo para demostrar la complejidad involucrada.
Ejemplo: producción de insulina recombinante
Un ejemplo es para la producción de insulina usando ADN recombinante como se describe por Orgad Laub et. Alabama. en Ref [2] y [6].
En este ejemplo, el vector utilizado es SV40. Se usa para introducir el gen de la insulina humana en el plásmido pBR322 (E. coli se usó para la amplificación de genes) (el gen de la insulina en sí mismo es con los enlazadores BamHI para ayudar a vincular los sitios de restricción)
El plásmido se introduce en la célula CV1 (derivado del mono verde africano) y se expresa el gen.
Paso a paso
Consulte el diagrama
El gen de insulina está presente en un plásmido pBR322 (designado PIns96). El gen de insulina en el plásmido PIns96 se cortó en dos sitios de restricción; HincII y BamHI.
Una porción forma un enlace al fragmento de 3209 pb. (No estoy seguro de por qué Hinc II se conecta con Hpa I). Esta combinación forma E-SVins. Este E-SVins se escindirá más tarde (no se muestra en el diagrama) en el sitio de restricción BamHI y se clonará dentro del plásmido pBR322. El gen se amplifica dentro de E.Coli HB101
Otra porción del gen de insulina se combina con 2840 pb. Este fragmento también se agrega con un fragmento SV40 de 525 pb (no del todo seguro de su propósito). El combinado se designa L-SVins. Luego se escinde en el sitio EcoRI (no se muestra en el diagrama) y se clona dentro de pBR322. El gen también se amplifica dentro de E. Coli HB101. El L-SVins en sí mismo es un ayudante complementario de E-SVins
Tanto E-SVins como L-SVins se transfectan en células CV1 (derivadas de un mono verde africano).
Para más detalles, lea: http://www.jbc.org/content/258/1…
OTRAS LECTURAS RELACIONADAS
Para una historia corta, lee ref [1]
Aquí hay una descripción de cómo se fabrica la insulina recombinante: cómo se produce la insulina
REFERENCIAS: –
[1] Lo más destacado de los cortadores de ADN: una breve historia de las enzimas de restricción Wil AM Loenen1, *, David TF Dryden2, *, Elisabeth A. Raleigh3, *, Geoffrey G. Wilson3, * y Noreen E. Murray http: // nar.oxfordjournals.org/co…
[2] Expresión del gen de la insulina humana en una célula de mamífero alternativa y en extractos celulares Orgad Laub, Leslie Rall, Graeme I. Bell y William J. Rutter http://www.jbc.org/content/258/1…
[3] https://www.neb.com/~/media/NebU…
[4] http://www.jbc.org/content/258/1…
[5] Clonación molecular de un gen de glucoamilasa de un Clostridium termófilo y cinética de la enzima clonada
[6] Expresión del gen de insulina humana y ADNc en un sistema de mamífero heterólogo * (Recibido para su publicación el 18 de octubre de 1982) Orgad LaubS y William J. Rutter http://www.jbc.org/content/258/1…
[7] células COS
Patente US4946789 – cepas de Bacillus brevis y su aplicación
