¿Cómo funciona la secuenciación de proteínas a través de la degradación de Edman?

Las degradaciones de Edman, con muchas modificaciones en los secuenciadores y condiciones, y la secuencia siguiente a las degradaciones, fueron (y posiblemente son) valiosas para encontrar la composición de aminoácidos de proteínas hoy en día, aunque otras técnicas las han reemplazado en popularidad, eficiencia y precisión. algunas de las cuales son solo modificaciones de la degradación original. Tenga en cuenta que dije que “secuenciación” y “degradaciones de Edman” son cosas completamente diferentes, eso se debe a que están separadas física y conceptualmente. Un principio rector aquí es que la secuenciación del ADN está “a años luz” de la secuenciación de proteínas, y este tipo de técnicas de secuenciación generalmente están diseñadas para identificar una proteína que ya ha sido altamente purificada, no una sopa de proteínas mixtas, comparable a la secuenciación del ADN.

Abordemos primero la química orgánica de las degradaciones de Edman (las degradaciones mismas). Luego podemos hablar sobre los métodos de secuenciación, que son mucho más numerosos y, hasta cierto punto, más complejos. El “por qué” de la mayoría de las secuencias está en el procedimiento de degradación.

Las proteínas son aminoácidos en diversas conformaciones. No queremos degradar / dividir / “atacar” las partes únicas de los aminoácidos que comprenden esas proteínas, por lo que optamos por concentrarnos en los enlaces amida relativamente estables que las conectan * . Más sobre esto más tarde también.

1. Química orgánica de la degradación (original) de Edman :

(o, a todos les gusta la química orgánica)
1.a. Enlaces de amida en proteínas
Los enlaces de amida (péptido) son muy estables, planar (en todos los aminoácidos y la mayoría de otros compuestos orgánicos) y resonantes, especialmente en entornos de pH no extremo. Estos enlaces son difíciles de protonar y no son muy reactivos en general, pero son definitivamente polares, con un momento dipolar de 3.7 D que apunta paralelo al enlace C = O, lo que facilita la unión de hidrógeno.

Dibujo de resonancia simplificado y mapa de potencial electrostático simplificado (el acetaldehído es solo para comparar, desea observar la región oscura alrededor del carbonilo y el nitrógeno de la amida en formamida):
24.5 Clases comunes de compuestos orgánicos

Momento dipolar a través de una amida:
Interacciones moleculares (interacciones no covalentes)

Finalmente, la densidad de electrones se extiende más dentro de los grupos amida que a través de enlaces adyacentes que conectan RC-N y RCC = O. Aquí hay una imagen de la densidad de carga a través de un enlace de amida primaria donde el nitrógeno es secundario y tiene un hidrógeno unido a él:
IUCR

De manera similar a los dibujos de resonancia simples de enlaces amida deslocalizados, incluso un enlace amida aislado muestra una densidad de carga distribuida de manera desigual por todo el enlace y no solo en el carbonilo y el nitrógeno. Las líneas de densidad muestran la agrupación cerca de los extremos del doble enlace C = O y el nitrógeno, pero no tanta reducción de densidad de ellos como lo esperaríamos de los principios básicos solamente.

El punto aquí es que el enlace amida no es tan básico como una amina (RN-) o tan ácido como un grupo carbonilo (RC = O) – la deslocalización de los electrones a través de los átomos de nitrógeno, oxígeno y carbono, la capacidad del oxígeno del carbonilo al enlace de hidrógeno, así como el momento dipolar significativo (3.7 D de la fuente en la imagen de arriba), apuntando en paralelo al enlace C = O, lo hacen lo suficientemente reactivo para degradarse con fenilisotiocianato, el reactivo de Edman, pero no muy reactivo en general.

1.b. Orientación de aminoácidos N-termini
* Entonces, de todo lo anterior, “eludimos” los enlaces amida apuntando a los terminales N de (residuos de grupos amino primarios) en los “extremos” de cadenas de aminoácidos, porque esos son muy nucleofílicos y básicos, y por lo tanto reactivo. El reactivo de Edman, un agente derivatizante llamado fenilisotiocianato, es tan efectivo que convierte el siguiente grupo de amida más cercano en un extremo N, o grupos amina (H2N-R). Por lo tanto, eludimos por completo los enlaces de amida convirtiéndolos en grupos amina más reactivos. Eso no es todo lo que hace el fenilisotiocianato: su otra función importante es ser lo suficientemente reactivos para convertir el aminoácido etiquetado en algo que sea detectable mediante fluorescencia u otros métodos.

1.c. Fenilisotiocianato (PITC), el reactivo de Edman
Este es el caballo de batalla del procedimiento de degradación. Discutiré reactivos alternativos (o un enlace a ellos) cuando analice las variantes modernas a continuación, pero los principios de ruptura de enlaces peptídicos o de objetivos N-terminados siguen siendo los mismos, y se basan en las propiedades de PITC, también llamado Reactivo de Edman. Aquí está la estructura básica de fenilisotiocianato, con una nota que el contribuyente de resonancia más estable es el de la izquierda (A) sin carga formal y tres pares de electrones solitarios.
Cristales líquidos de alta birrefringencia

Ahora, si traducimos esto a “reactividad”, como hicimos anteriormente con los enlaces de amida, un mapa de potencial electrostático nos ayuda a entender mucho (aunque esto solo es un derivado de fenilisotiocianato):
Estudio teórico de 1- (4-hexilciclohexil) -4-isotiocianatobenceno: propiedades moleculares y características espectrales

El contribuyente de resonancia más estable no tiene carga, pero el mapa de potencial electrostático nos muestra que la polaridad real es casi como si el átomo de azufre estuviera cargado negativamente de todos modos ya que tiene dos pares solitarios; las nubes rojas indican grandes valores de electronegatividad de Pauling y los azules indican valores más bajos Entonces, el reactivo aquí es realmente el enlace doble C =: S: donde el C es más electropositivo que lo normal. Esto significa que el enlace C = S es el enlace primario de PITC que participa en el ataque en el extremo N de lo que estamos secuenciando, y cuando observamos el mecanismo, ese PITC básicamente hace que los enlaces amida sean más reactivos y los divide a hacer más N-termini debido a ese único enlace C = S.

1.d. Mecanismo
Comparado con el mecanismo simple a continuación, una combinación moderna de degradación / análisis puede parecer irreconocible, pero incluso los reactivos y degradaciones de Edman modificados siguen la mayoría de los principios que esbozaré debajo de estas imágenes.

Las fases son muy importantes, incluso en la antigua degradación de Edman. Dividiremos y “etiquetaremos” un grupo de aminoácidos en diferentes pasos para tratar de identificarlos de alguna manera. La degradación de Edman (original) utilizó reactivo de Edman en fase líquida y aminoácidos etiquetados que se adsorbieron en una superficie sólida y luego se cortaron en la superficie con reactivos ácidos. Hoy esas superficies pueden ser perlas enlazadoras con etiquetas de afinidad para tipos específicos de aminoácidos unidos a ellas, estamos tratando con bibliotecas combinatorias de péptidos más pequeños y más grandes que tienen aminoácidos artificiales y naturales, y todo se encuentra en cantidades increíblemente pequeñas y vastamente paralela. Hoy en día, los grupos protectores y todo tipo de derivados de PITC están implicados en los mecanismos a continuación como sustratos, pero los conceptos básicos de las imágenes siguientes siguen siendo los mismos.

La degradación de Edman antigua / real sigue / ed este mecanismo para los alfa-aminoácidos ** (algunos detalles muy importantes están debajo de ambas imágenes):
Química orgánica , Carey / Giuliano, 8e

La parte B de la imagen de abajo ofrece una vista más grande de la degradación de Edman, mientras que la parte A es el método de Sanger:
Principios de Bioquímica , Lehninger

Entonces, cuando agrega el reactivo Edman (PITC), desea agregarlo en una solución que sea levemente básica o inerte para evitar que nuestro preciado reactivo Edman sea inactivado por la acidez (o basicidad para el caso: el enlace N = C = S tiene un átomo de C muy electrófilo) y para evitar que los aminoácidos se vuelvan zwitteriónicos y posiblemente peligrosamente reactivos / desnaturalizados. Las soluciones que funcionan incluyen piperidina, piridina y otras sustancias suaves en hexano o tolueno, etc. Este paso de reorganización no es sensible al tiempo y se puede separar de los demás (como la mayoría de los demás pasos de esta degradación).

Las etapas de “liberación” y acidificación del aducto de feniltiocarbamoilo (PTC) están físicamente separadas de la siguiente reacción del péptido acortado, por razones de diferente reactividad y acidez. El ácido trifluoroacético es muy fuertemente ácido (muy bajo pKa) y de ambas imágenes, cualquier ácido fuerte funcionará para los pasos de redisposición y eliminación catalizados por ácido, pero ya que no queremos destruir el aducto de PTH formado al final de la derivatización , el ácido se agrega en cantidades, tiempos y concentraciones limitados en la mayoría de estos pasos.

Los pasos de “remoción” requieren tanto calor como ácido, mientras que la reordenación de los derivados de AA para formar un anillo protonado de anilinotiazolinona (AZT) necesita solo ácido suave, ya que los átomos altamente electronegativos en los anillos desestabilizan ligeramente el anillo (y tiene tres carbonos electropositivos bien).

Luego hay un paso final para limpiar el sistema (usando cloruro de n-butilo) que no se muestra en las imágenes anteriores antes de seguir con los pasos. Este cloruro precipitará los aminoácidos derivatizados de la solución de una fase líquida, suponiendo que estamos usando perlas de unión u otros soportes sólidos. Ese sólido precipitado es fácil de identificar, pero puede no ser necesariamente lo que estamos buscando.

Aparte: PITC puede reaccionar consigo mismo para formar varios productos secundarios llamados DPTU y DMPTU-difeniltiourea y dimetilfeniltiourea, lo que limita parte de la eficiencia a menos que se agregue un exceso de PITC, que a menudo es el caso.

Finalmente, es más fácil apreciar cuán secuencial y separable (¡y automatizable!) Es esta reacción cuando dividimos los pasos en la formación de aducto básica, la acidificación del aminoácido restante y la acidificación del anillo de AZT para reorganizarlo en una feniltiohidrantoína (PTH) producto Es notable ver cómo la modulación de las condiciones ácido / base conduce a la degradación. Actualmente, el procedimiento de degradación no toma mucho tiempo (he visto 25 minutos para un solo ciclo en algunos periódicos).

1.e. Resumen
Tenemos un reactivo electroquímico y nucleofílico muy específico, estabilizado por resonancia, que se dirige a grupos muy específicos sin modificar las estructuras de aminoácidos *** salvo algunas rarezas ***, una reacción ácido-base muy específica y muy rápida después de agregar que reactivo y un paso ácido-base diferente para estabilizar el reactivo para la identificación (secuenciación). Esta reacción no tiene muchas limitaciones tal como están, pero cada vez más estas limitaciones se vuelven más importantes con nuestra comprensión de cómo los radicales dañan los aminoácidos (una respuesta que definitivamente publicaré más adelante) y el ADN y otras cosas, así como también y aminoácidos modificados que no funcionarán con el reactivo de Edman.

2. Limitaciones de la degradación

Como muchas otras técnicas de degradación, la degradación de Edman tiene muchas modificaciones, limitaciones, acoplamientos con otras técnicas, etc. ¡Sin embargo, los límites principales no están en la degradación misma! En realidad están en la secuencia, así que tenga en cuenta que, por más importantes que parezcan estos puntos, deberían considerarse en el contexto de que la eficiencia de la secuencia intentaba alcanzar la eficiencia de la degradación por más tiempo.

Nota: la masa no es realmente una limitación en la degradación (excepto por su relación con el número y conformaciones de aminoácidos en proteínas relacionadas con el N-terminal y el enlace de hidrógeno de la cadena principal de la cadena de amida, lo que dificulta los ataques nucleofílicos pero no imposible), es más una limitación en los pasos de secuenciación (identificación).

2.a. Tamaño y problemas asociados
Aquí hay una imagen de las hélices alfa y las hojas beta de una proteína con todos los enlaces amida y N-termini en verde, y la estructura de relleno de espacio debajo de eso:
Fotos del día 320N Primavera 2013

Mientras que las superficies accesibles de Van der Waals de proteínas y compuestos más pequeños en realidad se ven así: Visualización interactiva de contactos intermoleculares.

Teóricamente, la degradación comenzaría en un extremo N externo, si hay uno, y continuaría “hacia adentro” hasta que la mayoría de la cadena polipeptídica se rompa en “pedazos” de derivados de aminoácidos estables etiquetados más pequeños. La conclusión obvia aquí es que esta proteína globular es demasiado grande y demasiado unida por puentes de puentes / disulfuros de hidrógeno en general para que la degradación original de Edman funcione de manera efectiva (rápida) sin modificaciones.

Esta es la primera y principal limitación de una degradación de Edman: la necesidad de pequeños (<30 (25 se arroja mucho)) – Fragmentos de AA sin muchos enlaces entre AA para que el acoplamiento ácido / base se degrade completamente por completo.

2.b. Estúpidos grupos funcionales
Si hay algo en el camino del isotiocianato de fenilo (y todos los reactivos posteriores) en el extremo N libre, como un grupo acilo o cualquier cosa que dificulte el ataque de / provoque ataques alternativos del reactivo de Edman, tenemos que agregar enzimas o muy grupos protectores / reactivos muy específicos que pueden quitarlos del camino (véanse documentos como: eliminación de grupos N-acetilo de péptidos bloqueados con acilpeptida hidrolasa). Con la variedad y la gran especificidad de los grupos protectores del grupo funcional, las perlas enlazadoras / etc., Y las enzimas, esto está aparentemente extendido en los documentos de metodología que usan degradaciones de Edman modificadas.
Esto no es una gran preocupación, pero la eficiencia casi siempre se puede mejorar para la degradación y secuenciación general, y una pequeña mejora antes de los pasos de secuenciación puede ahorrar mucho material, tiempo y costo más adelante.

2.c. ** Oddball aminoácidos
La degradación en sí misma requiere aminoácidos específicos para funcionar (alfa-aminoácidos, lo que significa que el grupo de ácido carboxílico debe estar unido al mismo carbono que el grupo amina) y la proteína de interés ha (d) es bastante pequeña y purificada en términos de composición de aminoácidos. Estas son malas noticias para cualquier proteína con aminoácidos artificiales, fosforilados, sulfonados, glicosilados, nitrados o aminoácidos radicales, cualquier grupo amino libre y cualquier otro grupo o compuesto básico que pueda ser parte de la proteína. Esto se debe a que el paso de ciclación creará un heterociclo diferente si los R-groups o N-termini tienen átomos electronegativos o electropositivos. En otras palabras, la reacción original no funcionará correctamente (la proteína permanecerá y no se degradará si una cantidad suficiente del reactivo de Edman reacciona con cosas raras).

2.d. Soluciones
A menudo, necesitamos agentes reductores (DTT para enlaces disulfuro) y otros desnaturalizantes químicos de enlaces cruzados o enlaces de hidrógeno muy específicos. Entonces, después de que esos enlaces disulfuro y / o hidrógeno se rompan, fragmentar las proteínas más grandes en trozos más pequeños (ver 1.e.) con intercaladores, ácidos y enzimas / otros métodos le permitirá a usted realmente preparar cosas que pueden degradarse de manera eficiente. La solución primaria parece ser la digestión química (N≡C-Br) o enzimática (tripsina, quimotripsina, etc.) actualmente, probablemente porque son baratos y específicos de los bonos. Después de los pasos de fragmentación, los fragmentos deben purificarse con HPLC u otros métodos para eliminar el exceso de aminoácidos / subproductos que podrían estar flotando en la solución de fase líquida o gaseosa que está utilizando. Luego puede ejecutar sus degradaciones reales en paralelo para obtener eficiencia, no necesariamente en fase sólida, y no como los secuenciadores originales de “taza giratoria” (Original Edman and Begg paper: A Protein Sequenator – Edman – European Journal of Biochemistry). Más sobre la secuencia en la próxima sección principal.

De hecho, modificar el reactivo de Edman es una buena manera de resolver muchos o la mayoría de estos problemas con respecto a la especificidad de aminoácidos pero no a grupos funcionales extraños: podemos hacer que el reactivo sea más o menos reactivo con preocupaciones secundarias sobre toxicidad, costo y eficiencia en la derivatización de los aminoácidos en cuestión.

3. Secuenciación

Ahora tiene una sopa (no necesariamente un líquido) de aminoácidos derivados de PTH junto con algunos cacharros o algo así (quién sabe con qué frecuencia los estudiantes usaron guantes). ¿Cómo los identificas?
Tenga en cuenta que no abordaré los métodos que no necesitan o no siguen inmediatamente la degradación de Edman. Hay otras preguntas para los métodos que no se usan o proceden a través de la degradación de Edman.

3.a. Métodos
En lugar de explicar los iones moleculares o la fragmentación o “tirar” moléculas a través de soluciones adsorbentes aquí, lo remitiré a estas respuestas sobre conceptos básicos y comparaciones de posibles técnicas de secuenciación, aunque no siempre en un contexto Edman:

El método original de Edman para verificar el producto producido y secuenciar la sopa: Cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa acoplada con espectroscopia UV-Vis para detectar fragmentos derivatizados separados de la proteína original:

• Agilent

Los derivados de PTH (los productos de degradación) dan bandas de absorción de alrededor de 296 nm en UV-Vis, y eso se altera en función del grado de conjugación pi en el sistema determinado por las propiedades de la cadena lateral del aminoácido, mientras que PITC sería de mayor longitud de onda . HPLC es bastante eficiente (abajo), y también lo es UV-Vis.

Modernos métodos de secuenciación / identificación:
HPLC (y combinaciones, debe incluir HPLC-MS, que es a la vez un método de degradación y secuenciación que omite la degradación de Edman):

• ¿Qué es la cromatografía en columna?
• ¿Cuáles son las similitudes y diferencias entre la electroforesis en gel y la cromatografía líquida?

La HPLC se basa en la polaridad y la solubilidad / fase de los aminoácidos derivatizados.

MS , MALDI

• ¿Cómo funciona un espectrómetro de masas? (La respuesta de Roger Mercer para mantener la tendencia de usar su experiencia analítica, la respuesta de Robert para los conceptos básicos).

ESI

• ¿Cuál es la explicación de un profano sobre el mecanismo de la espectrometría de masas por ionización por electrospray (ESI-MS)?

Las técnicas basadas en MS están basadas en la relación m / z, y eso funciona para fragmentos de aminoácidos o derivados que sabemos que tienen masas específicas.

Entonces, después de la degradación de Edman, podemos tomar derivados de PTH y cuantificarlos de diversas maneras, todos los cuales se basan en técnicas analíticas que son bastante efectivas, aunque algunas de ellas tienen limitaciones de velocidad y masa.

Finalmente, hay muchas formas de eludir por completo el procedimiento de secuenciación de la degradación; MS / MS es obvio y ampliamente utilizado.
Tandem MS (o MS / MS ):

• ¿Cuál es la máquina de cromatografía líquida / espectrómetro de masas más simple que uno podría comprar para uso personal?

4. Limitaciones en los métodos y soluciones de secuencia

4.a. Tamaño de nuevo
Debido a la eficacia limitada de cualquier máquina de secuenciación (las mejores son ahora > 99% eficientes y tenían <50% de eficiencia (?) Originalmente), el método tiene limitaciones de longitud de secuencia de tamaño de proteína / AA para que las proteínas y secuencias grandes se multipliquen en el fondo "(permanecen sin derivatizar por nuestro reactivo PITC), lo que imposibilita la identificación adicional. Este es el seguimiento al punto de "limitación de degradación de tamaño" anterior: las proteínas grandes son malas. No puede ingresar una proteína grande en ninguno de estos pasos y solo espera que MS o lo que sea lo fragmente adecuadamente y obtendrá un número y / o secuencia razonable.

Este tamaño también se refiere al hecho de que MS es una técnica de detección basada en masa, y que los residuos isoméricos, Leu / Ile, aminoácidos isobáricos y Gln / Lys pueden confundirse, aunque aparentemente en raras ocasiones, durante la secuenciación de MS.

4.b. Límites de masa (límites inferiores de detección)
Feto-atto-nano-. Estas escalas molares son de lo que estamos hablando: cantidades muy muy pequeñas (aparentemente, excepto que estamos tratando con picomoles de AA), y, como los picogramos, que son muy difíciles de detectar por el método original, es decir, nuestro UV -Espectroscopía Vis (o solo UV) y cromatografía HPLC de la sección 3. Esta es la principal limitación en todo el proceso, ya que los volúmenes de proteínas convencionales están en microlitros de extracciones (a menos que esté realizando una extracción de todo el órgano y obteniendo proteína ubicua ) que es difícil para los secuenciadores de cualquier método / tipo de secuencia, a menos que cambien algunas cosas. Además, todo el proceso de degradación se ha refinado una y otra vez, por lo que una verdadera técnica de degradación de la magia no sería posible dada la química de los péptidos y las proteínas que queremos degradar sin afectar la miríada de grupos funcionales presentes en el resto de su estructuras que preservan sus identidades.

4.c. Rendimiento (una limitación de todo el proceso de secuenciación / degradación)
El rendimiento repetitivo, o la cantidad de producto derivatizado de AA de la adición continua de PITC, ácido, base y calor, es un concepto importante para la degradación original de Edman. Los rendimientos repetitivos de incluso el 90% limitan la degradación original de Edman a aproximadamente 10 ciclos, e incluso el 99% sería de aproximadamente 30 ciclos. Afortunadamente, es posible obtener algo así como el 99.9% de eficiencia (está en uno de los artículos que he vinculado, lo prometo), que suele ser ciclos suficientes para atravesar una proteína de tamaño medio sin perder mucha información. Los péptidos cortos tienen rendimientos más bajos que las proteínas reales, y a veces, si la degradación se sigue con una etapa de fijación o inmovilización sobre un soporte sólido, el rendimiento disminuirá aún más.

4.d. Soluciones
No hay mucho que hacer sobre el tamaño o realmente sobre el rendimiento, y la masa es el límite principal de todos modos. Afortunadamente, la masa ni siquiera es realmente un límite: pnas.org.

Creo que obtuve la mayor parte de mi material de estos enlaces (?):
http://www.life.illinois.edu/bio…
CCCC 1966, Volumen 31, Número 9, Resúmenes pp. 3737-3743, Comprar artículo completo texto
Página en thermoscientific.com
Página en oswego.edu
Página en lifetechnologies.com
Secuenciación de Edman modificada
http://www.pnas.org/content/supp…
Página en www.toplab.de