De “Producción recombinante de péptidos antimicrobianos en E. coli: una revisión”
Protein Expression and Purification 80 (2011) 260-267
Expresión Fusion
La expresión de péptidos antimicrobianos en E. coli enfrenta dos desafíos. En primer lugar, la naturaleza antibacteriana de los péptidos los hace potencialmente fatales para el huésped productor. En segundo lugar, el tamaño pequeño de los péptidos y su alta propiedad catiónica los hace altamente susceptibles a la degradación proteolítica. Una estrategia que supera con eficacia ambos obstáculos es fusionar el péptido de interés con una proteína transportadora. El péptido diana se puede liberar de la fusión en una etapa posterior mediante escisión enzimática o química en el sitio correspondiente alrededor de la unión vehículo-péptido. El diseño de fusión imita la estructura precursora de los péptidos en su biosíntesis nativa [6]. La proteína transportadora, que cumple un papel similar al pro-segmento natural del péptido, protege el péptido de las proteasas celulares y el huésped del péptido tóxico. Los portadores comúnmente utilizados se dividen en dos categorías: portadores que mejoran la solubilidad y portadores que promueven la agregación. Además de estas dos categorías principales, las proteínas auto escindibles y las señales de secreción son portadores únicos que permiten la eliminación automática de etiquetas y la expresión secretora, respectivamente.
Portadores que mejoran la solubilidad
El pequeño modificador relacionado con la ubiquitina (SUMO) es relativamente
nuevo portador de fusión, que se ha demostrado que mejora el plegamiento y la solubilidad de
las proteínas diana [16,17]. Al igual que la tiorredoxina, su pequeño tamaño (11.2 kDa) permite
una relación de péptido a portador relativamente alta, que favorece el rendimiento de péptidos.
Además, la existencia de proteasa SUMO altamente específica facilita
liberación eficiente de la proteína / péptido del pasajero, que ofrece una ventaja única
a este sistema En 2008, un grupo de investigación en la Universidad de Emory (Atlanta, GA,
EE. UU.) Obtuvo una patente sobre la producción de péptidos antimicrobianos utilizando SUMO
sistema [18]. Recientemente, el mismo grupo demostró aún más la aplicación de
este sistema para la producción rentable de péptidos antimicrobianos en E. coli
[19]. Además de su función como operador de fusión, GST también sirve como
etiqueta de afinidad y permite que la fusión se purifique con glutatión inmovilizado.
Thioredoxin y SUMO, por otro lado, requieren etiquetas de afinidad adicionales para
purificación inicial de las proteínas de fusión. La afinidad más comúnmente utilizada
la etiqueta para este propósito es la etiqueta de hexahistidina (His-tag).
Lanzamiento del péptido
La proteasa SUMO es única ya que la enzima reconoce
Estructura terciaria de SUMO en lugar de motivos de secuencia corta. Como resultado, el
la enzima nunca se escinde dentro de la proteína de interés y permite la producción
de proteína diana con N-terminal nativo [16]. Además, la enzima es muy
robusto y mantiene la mayor parte de su actividad en urea 2 M Por lo tanto, la proteasa SUMO es
adecuado para disolver insolubles solubilizados por urea y posteriormente diluidos
fusiones Otra enzima que no es inhibida por la baja concentración de urea es
la proteasa del virus del grabado con tabaco (TEV). También como la proteasa SUMO, la TEV
la proteasa puede generar N-terminal nativo en muchos casos [69]. El resistente a la urea
propiedad de las proteasas SUMO y TEV es una gran ventaja de estas dos enzimas para
la presencia de una pequeña cantidad de urea puede evitar la agregación de proteínas y aflojarse
estructuras compactas, lo que favorece la división. Una ventaja adicional de
Las proteasas SUMO y TEV es que ambas enzimas se pueden producir en grandes cantidades
con relativa facilidad. En comparación con las proteasas SUMO y TEV, enterocinasa,
el factor Xa y la trombina son más caros y más sensibles al pH y
caotropes.
Conclusiones
Recientemente, se ha demostrado que SUMO es una empresa eficiente
para la expresión soluble de proteínas / péptidos recombinantes. SUMO tiene todo el
ventajas de la tiorredoxina Además, la existencia de una gran especificidad y
la proteasa SUMO robusta agrega una ventaja adicional al sistema. La capacidad
del sistema SUMO para la producción a gran escala de péptidos antimicrobianos ha sido
demostrado en un documento reciente [19].
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