Trabajé con un laboratorio EM como técnico, luego roté a través de los laboratorios EM en mi primer año de posgrado. No me uní a un laboratorio en el campo cryo-EM para mi investigación doctoral (por varias razones que están más allá del alcance de esta respuesta).
Una ventaja del uso de cryo-EM para determinar la estructura de una proteína o complejo de múltiples proteínas es que el objetivo puede no cristalizar. Y, proteínas y complejos más grandes, que pueden ser más difíciles de cristalizar, son más adecuados para el estudio mediante cryo-EM. Dicho esto, no todas las reconstrucciones de cryo-EM pueden acercarse a la resolución atómica. Sin embargo, en conjunto con los datos bioquímicos o biofísicos o tal vez cristalográficos (de los dominios individuales, por ejemplo), los datos de resolución media a baja pueden ayudar a responder preguntas biológicas importantes.
Otra ventaja de cryo-EM es que las proteínas se estudian en solución, en condiciones casi nativas [1]. Por otra parte, varias conformaciones se pueden identificar a partir de un conjunto de datos, que corresponden a diferentes estados de la proteína o complejo [1]. Hasta este punto, los dominios flexibles o motivos tienen menos consecuencias [1].
Existen varias limitaciones en el uso de cryo-EM para determinar las estructuras de las proteínas. Primero, el corte de tamaño es de alrededor de 200 kDa [1]. En segundo lugar, las regiones más flexibles pueden ser difíciles de resolver [1]; esto puede figurar de manera más prominente en poblaciones más heterogéneas. En tercer lugar, la alta resolución a menudo puede eludir complejos más pequeños y menos simétricos.
Además, hay desafíos significativos que plantea la técnica. La preparación de la muestra puede ser difícil y los complejos pueden no responder bien a la congelación [1] o ser llevados a redes. Además, la infraestructura para apoyar este trabajo (microscopios electrónicos, cámaras, instrumentación para la preparación de la red y para el mantenimiento del titular, EM suite, microscopistas y personal técnico, etc.) es bastante costosa. Finalmente, la determinación de la estructura mediante cryo-EM es computacional y requiere mucha memoria [1].
[1] Southworth, Daniel R. (2017). “Cryo-EM ‘Resolution Revolution’: 2013-?” [Diapositivas de Powerpoint].
