¿Qué es la síntesis de péptidos?

La mejor compañía de síntesis de péptidos Custom Peptide Synthesis – Servicios de síntesis de péptidos de Bio-Synthesis Inc

Abstracto

Varios péptidos sintéticos son productos comerciales o farmacéuticos significativos, que van desde el dipéptido sustituto de azúcar, aspartamo, hasta hormonas usadas clínicamente, como la oxitocina, la hormona adrenocorticotrópica y la calcitonina. Esta unidad proporciona una visión general del campo de los péptidos y proteínas sintéticos. Discute la selección del soporte sólido y los reactivos de acoplamiento comunes. Se proporciona información adicional sobre las reacciones secundarias comunes y la síntesis de residuos modificados.

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DESARROLLO DE METODOLOGÍA DE SÍNTESIS DE PÉPTIDOS DE FASE SÓLIDA

Una serie de péptidos sintéticos son productos comerciales o farmacéuticos significativos, que van desde el sustituto de azúcar dipéptido, aspartamo, hasta hormonas usadas clínicamente, como la oxitocina, la hormona adrenocorticotrópica y la calcitonina (Pontiroli, 1998). En el año 2008, el mercado terapéutico de péptidos alcanzó el nivel de miles de millones de dólares (Saladin et al., 2009). Más de 400 péptidos han ingresado en estudios clínicos hasta el momento. Una metodología rápida, eficiente y confiable para la síntesis química de estas moléculas es, por lo tanto, de sumo interés. El ensamblaje gradual de péptidos a partir de precursores de aminoácidos se ha descrito durante casi un siglo. El concepto es sencillo, por lo que el alargamiento del péptido procede a través de una reacción de acoplamiento entre aminoácidos, seguido de la eliminación de un grupo protector reversible. La primera síntesis de péptidos, así como la creación del término “péptido”, fueron informados por Fischer y Fourneau (Fischer y Fourneau, 1901). Bergmann y Zervas crearon el primer N reversible

α

-grupo protector para la síntesis de péptidos, el grupo carbobenzoxi (Cbz) (Bergmann y Zervas, 1932). DuVigneaud aplicó con éxito estrategias “clásicas” tempranas para construir un péptido con actividad similar a la oxitocina (Vigneaud et al., 1953). Los métodos clásicos o de fase de solución para la síntesis de péptidos tienen una historia elegante y han sido bien documentados. La síntesis de la solución continúa siendo especialmente valiosa para la fabricación a gran escala y para aplicaciones de laboratorio especializadas.

La síntesis de péptidos se convirtió en una parte más práctica de la investigación científica actual después del advenimiento de las técnicas en fase sólida. El concepto de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) es retener la química que se ha demostrado en solución, pero añadir una etapa de unión covalente que une la cadena peptídica naciente a un soporte polimérico insoluble (resina). Posteriormente, el péptido anclado se extiende mediante una serie de ciclos de adición (figura 18.1.1). La esencia del enfoque en fase sólida es que las reacciones se lleven a cabo mediante el uso de reactivos solubles en exceso, que pueden eliminarse mediante simple filtración y lavado sin pérdidas por manipulación. Una vez que se ha completado el alargamiento de la cadena, el péptido bruto se libera del soporte.

Figura 18.1.1

[* Gwen: leyenda igual que la figura original]

A principios de la década de 1960, Merrifield propuso el uso de un soporte sólido basado en poliestireno para la síntesis de péptidos. Los péptidos se pueden ensamblar gradualmente del extremo C al N usando N

α

-aminoácidos protegidos. El SPPS de un tetrapéptido se logró utilizando Cbz como un grupo protector de α-amino , copulando con N, N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y liberando el péptido del soporte mediante saponificación o mediante el uso de HBr (Merrifield, 1963). SPPS se modificó más tarde para usar el grupo t -butiloxicarbonilo (Boc) para N

α

protección (Merrifield, 1967) y fluoruro de hidrógeno (HF) como el reactivo para la eliminación del péptido de la resina (Sakakibara et al., 1967). SPPS se basó en “acidólisis relativa”, donde el N

α

el grupo protector (Boc) era lábil en presencia de ácido moderado (ácido trifluoroacético, TFA), mientras que los grupos basados ​​en bencilo (Bzl) que protegen la cadena lateral y el enlace péptido / resina eran estables en presencia de ácido moderado y lábil en presencia de ácido fuerte (HF). Los enlaces peptídicos de la cadena ensamblada fueron estables a estas manipulaciones. El primer instrumento para la síntesis automática de péptidos, basado en Boc SPPS, fue construido por Merrifield, Stewart y Jernberg (Merrifield et al., 1966). Desde la década de 1960 hasta la década de 1980, se mejoró el SPPS basado en Boc (Merrifield, 1986). Esta estrategia se ha utilizado para la síntesis de proteínas tales como la interleucina-3 y enzimas activas que incluyen la ribonucleasa A y las formas all-l y all-d de la aspartil proteasa del VIH-1.

En 1970, Carpino introdujo el grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) para N

α

protección (Carpino y Han, 1970). El grupo Fmoc requiere una base moderada para la eliminación, y por lo tanto ofreció una alternativa químicamente suave al grupo Boc ácido-lábil. A fines de la década de 1970, el grupo Fmoc fue adoptado para aplicaciones en fase sólida. Las estrategias basadas en Fmoc utilizaron protectores de cadena lateral basados ​​en t- butilo ( t Bu) y engarces basados ​​en hidroximetilfenoxilo para la unión de péptidos a la resina. Este era, por lo tanto, un esquema “ortogonal” que requería una base para la eliminación de la N

α

– grupo protector y ácido para la eliminación de los grupos protectores de la cadena lateral y la liberación del péptido de la resina. Las condiciones más suaves de la química de Fmoc en comparación con la química de Boc, que incluyen la eliminación de pasos de acidolisis moderada repetitiva y la etapa de acidolisis fuerte final, se concibieron como más compatibles con la síntesis de péptidos que son susceptibles a reacciones secundarias catalizadas por ácido. En particular, la modificación del anillo indol de Trp se vio como un problema particular durante la síntesis de péptidos basados ​​en Boc (Barany y Merrifield, 1979), que podría aliviarse usando química Fmoc. Un ejemplo de la ventaja potencial de la química de Fmoc para la síntesis de péptidos que contienen Trp múltiples fue en la síntesis de gramicidina A. La gramicidina A, un pentadecapéptido que contiene cuatro residuos de Trp, se había sintetizado previamente en bajos rendimientos (5% a 24%). ) usando la química Boc. Las condiciones suaves de la química Fmoc mejoraron dramáticamente los rendimientos de gramicidina A, en algunos casos hasta 87% (Fields et al., 1989; Fields et al., 1990). Un segundo péptido que contiene Trp múltiple, indolicidina, se ensambló con éxito con alto rendimiento mediante química Fmoc (King et al., 1990). Por lo tanto, las condiciones suaves de la química Fmoc parecían ser ventajosas para ciertos péptidos, en comparación con la química Boc.

Uno de los desafíos posteriores para los profesionales de la química Fmoc fue refinar la técnica para permitir la construcción de proteínas, de manera similar a la que se había logrado con la química Boc. La química de Fmoc tenía su propio conjunto de problemas únicos, que incluyen la solvatación subóptima del péptido / resina, la cinética de acoplamiento lento y las reacciones secundarias catalizadas por la base. Las mejoras en estas áreas de la química Fmoc (Atherton y Sheppard, 1987; Fields et al., 2001; Fields y Noble, 1990) permitieron la síntesis de proteínas tales como análogos inhibidores de la tripsina pancreática bovina, ubiquitina, proteína de unión a la actina de levadura 539- 588, gonadotropina β-coriónica humana 1-74, mini-colágenos, proteína Tat de VIH-1, proteína de nucleocápside de VIH-1 NCp7 y proteasa de VIH-1 activa.

Las condiciones más suaves de la química Fmoc, junto con las mejoras en la química básica, han llevado a un cambio en la química empleada por los laboratorios de péptidos. Esta tendencia se ejemplifica mejor mediante una serie de estudios (Angeletti et al., 1997) llevados a cabo por el Comité de Investigación de Síntesis de Péptidos (PSRC) de la Asociación de Instalaciones de Recursos Biomoleculares (ABRF). El PSRC se formó para evaluar la calidad de los métodos sintéticos utilizados en sus laboratorios miembros para la síntesis de péptidos. El PSRC diseñó una serie de estudios de 1991 a 1996 para examinar los métodos sintéticos y las técnicas analíticas. Se observó un fuerte cambio en la química utilizada en las instalaciones centrales durante este período de tiempo, es decir, la metodología más alta Boc fue reemplazada por la química Fmoc. Por ejemplo, en 1991, el 50% de los laboratorios participantes utilizaron la química Fmoc, mientras que el 50% utilizó métodos basados ​​en Boc. En 1994, el 98% de los laboratorios participantes utilizaban la química Fmoc. Este porcentaje se mantuvo constante en 1995 y 1996. Además, la calidad general de los péptidos sintetizados mejoró considerablemente entre 1991 y 1994. Las posibles razones para la mejora de los resultados fueron cualquier combinación de los siguientes (Angeletti et al., 1997):

1. El mayor porcentaje de péptidos sintetizados por la química Fmoc, donde las condiciones de escisión son menos duras;
2. El uso de diferentes estrategias de grupos protectores de cadena lateral que ayudan a reducir las reacciones secundarias durante el clivaje;
3. El uso de protocolos de escisión diseñados para minimizar las reacciones secundarias;
4. Más rigor y cuidado en las técnicas de laboratorio.

El nivel actual de refinamiento de la metodología en fase sólida ha dado lugar a numerosos instrumentos disponibles comercialmente para la síntesis de péptidos (Tabla 18.1.1).

Tabla 18.1.1

Instrumentos para la síntesis de péptidos en fase sólida actualmente disponibles en el mercado.

El siguiente paso en el desarrollo de técnicas en fase sólida incluye aplicaciones para péptidos que contienen aminoácidos no nativos, aminoácidos modificados postraduccionalmente y pseudoaminoácidos, así como para moléculas orgánicas en general. Varias áreas de síntesis en fase sólida necesitan ser refinadas para permitir la construcción exitosa de esta nueva generación de biomoléculas. El soporte sólido debe ser versátil para que se pueda usar una gran variedad de solventes, particularmente para aplicaciones de moléculas orgánicas. Los reactivos de acoplamiento deben ser lo suficientemente rápidos para que puedan incorporarse aminoácidos estéricamente impedidos. La construcción de péptidos que contienen aminoácidos con modificaciones postraduccionales debe aprovechar el enfoque de fase sólida. Finalmente, se necesitan técnicas analíticas apropiadas para asegurar la composición adecuada de los productos.

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EL SOPORTE SÓLIDO

El SPPS exitoso depende de la elección del soporte sólido, el enlazador (entre el soporte sólido y el péptido sintetizado), aminoácidos apropiadamente protegidos, metodología de acoplamiento y protocolo para escindir el péptido del soporte sólido (Fields, 1997). La elección del soporte sólido correcto suele ser primordial para la síntesis exitosa y no problemática del péptido deseado. Actualmente, existe una gran cantidad de resinas disponibles comercialmente, adecuadas para la síntesis de péptidos complejos. Debe observarse que la solvatación efectiva del péptido / resina es quizás la condición más crucial para un ensamblaje de cadena eficiente durante la síntesis en fase sólida. Las perlas de resina hinchada pueden hacerse reaccionar y lavarse en lotes con agitación, luego se pueden filtrar con succión o bajo presión de nitrógeno positiva. Alternativamente, pueden empacarse en columnas y utilizarse en modo de flujo continuo bombeando reactivos y solventes a través de la resina (Lukas et al., 1981).

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H,

2

H,

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C, y

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Los experimentos de resonancia magnética nuclear (RMN) han demostrado que, en condiciones de solvatación adecuadas, las cadenas lineales de poliestireno de resina de copoli (estireno-1% -divinilbenceno) (PS) son casi tan accesibles a los reactivos como libres en solución (Albericio et al. ., 1989, Ford y Balakrishnan, 1981; Live y Kent, 1982; Ludwick et al., 1986, Manatt et al., 1980).

13

C y

19

Los estudios de RMN F de Pepsyn (dimetilacrilamida copolimerizada, N, N ‘- bisacriloiletilendiamina y éster metílico de acriloilsarcosina) han mostrado movilidades similares en sitios reactivos con resina como PS. Apoyos adicionales creados por injerto de polietilenglicol (polioxietileno) en PS [ya sea por polimerización aniónica controlada de óxido de etileno en tetraetilenglicol-PS (POE-PS) o por acoplamiento de N

ω

-Boc o Fmoc-polietilenglicol ácido o -polietilenglicol diácido a PS con funcionalidad amino (PEG-PS)] combinan las ventajas de la síntesis en fase líquida (es decir, un entorno de reacción homogéneo) y la síntesis en fase sólida (un soporte insoluble )

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Las mediciones de RMN C de POE-PS mostraron que las cadenas de polioxietileno son más móviles que la matriz PS, con la mayor T

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tiempos de relajación de espín-celosía observados con POE de peso molecular 2000 a 3000. Otros soportes que muestran propiedades de solvatación mejoradas y / o son aplicables a la síntesis orgánica incluyen polietilenglicol poliacrilamida (PEGA), resina de etoxilato de acrilato reticulado (CLEAR) y aumentada polietileno de superficie preparado por transformación química (ASPECT). A medida que el método de fase sólida se ha expandido para incluir moléculas orgánicas y síntesis de bibliotecas, la diversidad de soportes mejorará la eficiencia de estas nuevas aplicaciones.

Las síntesis exitosas de secuencias problemáticas se pueden lograr mediante la manipulación del soporte sólido. En general, cuanto más larga sea la síntesis, más polar será el péptido / resina (Sarin et al., 1980). Se puede alterar el entorno del disolvente y mejorar la eficacia del acoplamiento mediante la adición de solventes polares y / o agentes caotrópicos (Fields and Fields, 1994). Además, usar un nivel de sustitución más bajo de la resina para evitar el apiñamiento intercadena puede mejorar la síntesis (Tam y Lu, 1995). Durante las síntesis difíciles, la desprotección del grupo Fmoc puede avanzar lentamente. Mediante el monitoreo espectrofotométrico de la desprotección a medida que avanza la síntesis, se pueden detectar problemas y extender los tiempos de desprotección de bases y / o alterar las condiciones de solvatación según sea necesario.

La síntesis de péptidos en fase sólida se lleva a cabo tradicionalmente en la dirección C → N. La mayoría de los péptidos se están sintetizando como ácidos C-terminales o amidas. Para la síntesis de péptidos modificados C-terminales, se pueden aprovechar muchos enlazadores disponibles (Guillier et al., 2000). El uso de conectores proporciona control y flexibilidad del proceso sintético, por ejemplo, la funcionalización del aminoácido C-terminal, la carga del aminoácido C-terminal, y / o las condiciones de escisión utilizadas para la liberación del péptido después de la síntesis.

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REACTIVOS DE ACOPLAMIENTO

El término acoplamiento se refiere a la formación de un enlace peptídico entre dos aminoácidos adyacentes. El acoplamiento implica el ataque del grupo amino de un residuo en el grupo carbonilo del componente que contiene carboxi que ha sido activado por un grupo de extracción de electrones. La forma activada del aminoácido puede ser un reactivo estable al almacenamiento, un compuesto de estabilidad intermedia o un intermediario transitorio que no es aislable ni detectable (El-Faham y Albericio, 2011).

Los ejemplos clásicos de reactivos de acoplamiento in situ son N, N ‘- diciclohexilcarbodiimida (DCC) y la N, N ‘ – diisopropilcarbodiimida relacionada (Rich y Singh, 1979). La generalidad de los acoplamientos mediados por carbodiimida se amplía significativamente mediante el uso de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) o 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) como aditivo, cualquiera de los cuales acelera los acoplamientos mediados por la carbodiimida, suprime la racemización e inhibe deshidratación de las cadenas laterales de carboxamida de Asn y Gln a los nitrilos correspondientes. Protocolos que incluyen hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris (dimetilamino) fosfonio (BOP), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris (pirrolidino) fosfonio (PyBOP), 7-azabenzotriazol-1-il-oxitris (pirrolidino) hexafluorofosfato de fosfonio (PyAOP), hexafluorofosfato de O -benzotriazol-1-il- N, N, N ‘, N ‘ -tetrametiluronio (HBTU), O – (7-azabenzotriazol-1-yl) – N, N, N ‘ N ‘ hexafluorofosfato de tetrametiluronio (HATU), hexafluorofosfato de O- (6-clorobenzotriazol-1-il) -N, N, N ‘, N’-tetrametiluronio (HCTU) y O -benzotriazol-1-il- N, N, N’ , El tetrafluoroborato de N ‘-tetrametiluronio (TBTU) da como resultado una cinética de acoplamiento incluso más rápida que la obtenida con carbodiimidas. Los halogenuros de aminoácidos también se han aplicado a SPPS. norte

α

Los cloruros de aminoácidos protegidos tienen una larga historia de uso en la síntesis de soluciones. Los cloruros y fluoruros de Fmoc-aminoácidos reaccionan rápidamente en condiciones de SPPS en presencia de HOBt / N, N- diisopropiletilamina (DIEA) y DIEA, respectivamente, con niveles muy bajos de racemización. Por conveniencia, puede usarse hexafluorofosfato de tetrametilfluoroformamidinio (TFFH) para la preparación automatizada de fluoruros de Fmoc-aminoácido. Se ha encontrado que los fluoruros de aminoácidos son especialmente útiles para la preparación de péptidos que contienen aminoácidos estéricamente impedidos, tales como peptaibols. Otros agentes de acoplamiento que dan como resultado bajos niveles de epimerización, y por lo tanto son particularmente útiles para ciclaciones de péptidos de cabeza a cola y condensaciones de fragmentos, incluyen O- (3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina- Tetrafluoroborato de 3-il) -N, N, N ‘, N’-tetrametiluronio (TDBTU) y 3- (dietilfosforiloxi) -1,2,3-benzotriazin-4 (3H) -ona (DEPBT). Todos los reactivos de acoplamiento y aditivos discutidos aquí están disponibles comercialmente (Tabla 18.1.2).

Tabla 18.1.2

Lista de proveedores de reactivos de síntesis de péptidos. [* Gwen: elimina las cajas, así que es solo una lista simple.]

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SÍNTESIS DE RESIDUOS Y ESTRUCTURAS MODIFICADOS

Los péptidos de interés biológico a menudo incluyen elementos estructurales más allá de los 20 aminoácidos genéticamente codificados. Se ha puesto especial énfasis en los péptidos que contienen residuos fosforilados o glicosilados o puentes disulfuro. La incorporación de Ser y Thr fosforilada por SPPS es especialmente desafiante, ya que el grupo fosfato se descompone por ácido fuerte y se pierde con base en un proceso de eliminación β. Boc-Ser (PO

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fenilo

2

) y Boc-Thr (PO

3

fenilo

2

) se ha encontrado que son derivados útiles, donde el fluoruro de hidrógeno (HF) o la hidrogenolisis escinden el péptido / resina y la hidrogenolisis elimina los grupos fenilo. Fmoc-Ser (PO

3

Bzl, H) y Fmoc-Thr (PO

3

Bzl, H) se puede usar junto con la química de Fmoc con cierto cuidado (Perich et al., 1999; Wakamiya et al., 1994). Alternativamente, los péptidos / resinas que se acumularon mediante química Fmoc para incluir cadenas laterales Ser o Thr no protegidas pueden estar sujetos a fosforilación “global” o posterior al ensamblaje (Otvös et al., 1989a). La Tyr fosforilada de cadena lateral es menos susceptible a la descomposición de ácidos fuertes y no es en absoluto inestable a bases. Por lo tanto, SPPS se ha utilizado para incorporar directamente Fmoc-Tyr (PO

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metilo

2

) (Kitas et al., 1989), Fmoc-Tyr (PO

3

t Bu

2

) (Perich y Reynolds, 1991), Fmoc-Tyr (PO

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H

2

) (Ottinger et al., 1993) y Boc-Tyr (PO

3

H

2

) (Zardeneta y otros, 1990). La fosforilación también se puede realizar en línea, directamente después de la incorporación del residuo Tyr, Ser o Thr, pero antes del ensamblaje del péptido completo (Perich, 1997).

La metodología para la incorporación específica de sitio de carbohidratos durante la síntesis química de péptidos se ha desarrollado rápidamente. Las condiciones suaves de la química de Fmoc son más adecuadas para la síntesis de glicopéptidos que la química de Boc, ya que los tratamientos con ácidos repetitivos pueden ser perjudiciales para los enlaces de azúcar. Se han incorporado Fmoc-Ser, -Thr, -5-hidroxilisina (-Hyl), -4-hidroxiprolina (-Hyp) y -Asn con éxito con cadenas laterales glicosiladas (Cudic y Burstein, 2008). El glucosilo de cadena lateral suele estar protegido con hidroxilo por grupos benzoilo o acetilo, aunque algunos SPPS han tenido éxito sin protección de los grupos glicosil hidroxilo (Otvös et al., 1989b). La desacetilación y la desbencilación se realizan con hidrazina / metanol antes de la escisión de glucopéptidos / resina o en solución con metóxido catalítico en metanol (Sjölin et al., 1996).

La formación de enlaces disulfuro se ha logrado en la fase sólida por vía aérea, K

3

Fe (CN)

6

, ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) o oxidación con diiodoetano de sulfhidrilos libres, por desprotección / oxidación directa de residuos de Cys (acetamidometilo) usando trifluoroacetato de talio o I

2

, por conversión directa de residuos de Cys (9-fluorenilmetil) usando piperidina, y por ataque nucleófilo por un sulfhidrilo libre sobre Cys (3-nitro-2-piridinesulfenilo) o Cys ( S- carboximetilsulfenilo). El método más aplicable y eficiente de estos métodos es la conversión directa de residuos de Cys (acetamidometilo) por trifluoroacetato de talio. En solución, la formación de disulfuros puede estar mediada por un extenso catálogo de reactivos, el más sencillo de los cuales es el O molecular.

2

(del aire) y DMSO (Tam et al., 1991).

Las lactamas intracatenarias se forman entre las cadenas laterales de Lys u Orn y Asp o Glu para restringir conformacionalmente los péptidos sintéticos, con el objetivo de aumentar la potencia y / o especificidad biológica. Las lactámicos también se pueden formar a través de una ciclación de cadena lateral a cabeza, de cadena lateral a cola o de cabeza a cola (Kates et al., 1994). Los residuos usados ​​para formar lactamas intracatenarias deben desprotegerse selectivamente de cadena lateral, mientras que todos los grupos protectores de cadena lateral de otros residuos permanecen intactos. La desprotección selectiva se logra mejor mediante el uso de protección de cadena lateral ortogonal, como aliloxicarbonilo o 1- (4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno) protección de etilo para Lys y alilo o N- [1- (4 , 4, -dimetil-2,6-dioxociclohexiliden) -3-metil-butil] aminobencil-protección para Asp / Glu en combinación con una estrategia Fmoc / t Bu. La ciclación se lleva a cabo de manera más eficiente con BOP en presencia de DIEA mientras el péptido todavía está unido a la resina (Felix et al., 1988; Plaue, 1990).

El esquema de protección ortogonal tridimensional de los grupos protectores Fmoc / t Bu / alilo es la estrategia de elección para las ciclaciones de cabeza a cola. Se usa un enlazador de amida para la unión de una cadena lateral de un Asp / Glu C-terminal (que se convierte en Asn / Gln) y el grupo α-carboxilo está protegido como un éster alílico (Stawikowski y Cudic, 2006). Para las ciclaciones de cadena lateral a cabeza, el aminoácido N-terminal (cabeza) puede simplemente introducirse como un N

α

-Foco derivado mientras que el enlace péptido-resina y los otros grupos protectores de la cadena lateral son estables para diluir el ácido o tienen una tercera dimensión de ortogonalidad.

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SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

Hay tres enfoques químicos generales para construir proteínas. Primero es la síntesis por etapas, en la que toda la proteína se sintetiza un aminoácido a la vez. El segundo es el “ensamblaje de fragmentos”, en el que las cadenas de péptidos individuales se construyen inicialmente por etapas, se purifican y finalmente se unen covalentemente para crear la proteína deseada. El ensamblaje de fragmentos se puede dividir en dos enfoques distintos: (1) síntesis convergente de fragmentos totalmente protegidos, y (2) ligadura quimioselectiva de fragmentos no protegidos. Tercero es el “ensamblaje dirigido”, en el que las cadenas peptídicas individuales se construyen por etapas, se purifican y luego se dirigen no covalentemente para asociarlas a estructuras similares a proteínas. Las combinaciones de los tres enfoques químicos generales también se pueden emplear para la construcción de proteínas.

La síntesis convergente utiliza fragmentos peptídicos protegidos para la construcción de proteínas (Albericio et al., 1997). La ventaja de la síntesis proteica convergente es que los fragmentos de la proteína deseada se sintetizan, purifican y caracterizan primero, asegurando que cada fragmento sea de alta integridad; estos fragmentos se ensamblan en la proteína completa. Por lo tanto, los efectos acumulativos de los errores sintéticos por pasos se reducen al mínimo. La síntesis convergente requiere un acceso rápido a segmentos peptídicos puros parcialmente protegidos, que se necesitan como bloques de construcción. La aplicación de síntesis en fase sólida para preparar los intermedios requeridos depende de varios niveles de grupos protectores y enlazadores escindibles selectivamente. Los métodos para la posterior solubilización y purificación de los segmentos protegidos no son triviales. Las velocidades individuales para los segmentos de acoplamiento son sustancialmente menores que para las especies de aminoácidos activadas por síntesis por etapas, y siempre existe el riesgo de racemización en el extremo C de cada segmento. Una cuidadosa atención al diseño sintético y la ejecución pueden minimizar estos problemas.

Como alternativa al enfoque de condensación de segmentos, se han desarrollado métodos mediante los cuales se pueden unir fragmentos de péptidos no protegidos. La “ligación química nativa” da como resultado un enlace de amida generado entre los fragmentos de péptido (véase la UNIDAD 18.4 ) (Muir et al., 1997). Un péptido que lleva un tioácido C-terminal se convierte en un éster de ácido 5-tio-2-nitrobenzoico y luego se hace reaccionar con un péptido que lleva un residuo Cys N-terminal (Dawson et al., 1994). El producto de ligación de tioéster inicial se somete a una reorganización espontánea, lo que conduce a un enlace de amida y a la regeneración del sulfhidrilo libre en Cys. El método se refinó más tarde de modo que se puede usar un tioéster relativamente no reactivo en la reacción de ligación (Ayers et al., 1999, Dawson et al., 1997). Los enlazadores de “captura de seguridad” se usan junto con la química de Fmoc para producir el péptido tioéster necesario (Shin et al., 1999). Los enlazadores de captura de seguridad anclan el péptido naciente a la resina y son estables durante toda la síntesis. Estos enlazadores permiten entonces la liberación de un péptido modificado en el extremo C desde el soporte sólido en condiciones suaves después de un paso de activación adicional.

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REACCIONES LATERALES

El N libre

α

-El grupo amino de un dipéptido anclado está listo para un ataque intramolecular catalizado por base del carbonilo C-terminal. La desprotección de bases del grupo Fmoc puede liberar una dicetopiperazina cíclica mientras que un grupo saliente con mango de hidroximetilo permanece en la resina. Con residuos que pueden formar enlaces peptídicos cis , por ejemplo, Gly, Pro, N- metilaminoácidos o d-aminoácidos, en la primera o segunda posición de la síntesis ( C → N ), la formación de dicetopiperazina puede ser sustancial. El impedimento estérico del engarce de 2-clorotritilo puede minimizar la formación de dicetopiperazina de secuencias susceptibles durante la química de Fmoc.

La conversión de residuos de Asp protegidos en cadenas laterales a residuos de aspartimida puede ocurrir mediante tratamientos básicos repetitivos. La aspartimida cíclica puede reaccionar luego con piperidina para formar el α- o β-piperidide o α- o β-peptide. La formación de aspartimida puede ser rápida y depende del grupo protector de la cadena lateral Asp. Los estudios de dependencia de secuencia de los péptidos Asp (O t Bu) -X revelaron que la piperidina podría inducir la formación de aspartimida cuando X = Arg (2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo; Pmc), Asn (trifenilmetilo; Trt) , Asp (O t Bu), Cys (Acm), Gly, Ser, Thr y Thr ( t Bu) (Lauer et al., 1995). La formación de aspartimida también puede ser dependiente de la conformación. Esta reacción secundaria se puede minimizar incluyendo HOBt 0,1 M en la solución de piperidina (Lauer et al., 1995) o utilizando un grupo protector de la cadena principal de amida (es decir, 2-hidroxi-4-metoxibencilo) para el residuo en la X posición de una secuencia de Asp-X (Quibell et al., 1994).

Los residuos de Cys se racemizan mediante tratamientos de desprotección de piperidina repetidos durante Fmoc SPPS. La racemización de Cys esterificada (C-terminal) se puede reducir usando 1% de 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-eno en N, N -dimetilformamida (DMF). Además, el obstáculo estérico del engarce de 2-clorotritilo minimiza la racemización de los residuos de Cys C-terminales. Cuando se aplican protocolos para la incorporación interna de Cys (no C-terminal) que incluyen sales de fosfonio y aminio como agentes de acoplamiento, así como la preactivación en presencia de aditivos adecuados y bases de amina terciaria, se observa una racemización significativa. La racemización generalmente se reduce evitando la preactivación, usando una base más débil (como colidina) y cambiando a la mezcla de solventes DMF-diclorometano (DCM) (1: 1). Alternativamente, se puede usar el éster de pentafluorofenilo de un derivado de Fmoc-Cys adecuado.

La combinación de grupos protectores de cadena lateral y enlaces de anclaje comúnmente usados ​​en la química de Fmoc se desprotegen y escinden simultáneamente por TFA. La escisión de estos grupos y enlazadores da como resultado la liberación de especies reactivas que pueden modificar residuos susceptibles, como Trp, Tyr y Met. Las modificaciones pueden minimizarse durante la segmentación de TFA utilizando barridores eficaces. Tres “cócteles” de escisión eficientes que apagan las especies reactivas y preservan la integridad de los aminoácidos, son (1) TFA-fenoltioanisol-1,2-etanoditiol-H

2

O (82.5: 5: 5: 2.5: 5) (reactivo K) (King et al., 1990), (2) TFA-tioanisol-1,2-etanoditiol-anisol (90: 5: 3: 2) (reactivo R) (Albericio et al., 1990), y (3) TFA-fenol-H

2

O-triisopropilsilano (88: 5: 5: 2) (reactivo B) (Solé y Barany, 1992). El uso de la protección de cadena lateral de Boc de Trp también reduce significativamente la alquilación por grupos Pmc o 2,2,4,6,7-pentametildihidro-benzofuran-5-sulfonilo (Pbf). Para una lista de problemas comunes encontrados durante la síntesis de péptidos, consulte la Tabla 18.1.3.

Tabla 18.1.3

Problemas comunes encontrados durante la síntesis de péptidos.

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PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE PÉPTIDOS SINTÉTICOS

Cada procedimiento sintético tiene limitaciones, e incluso en manos de trabajadores con mucha experiencia, ciertas secuencias desafían la preparación fácil. La maduración de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ha sido una gran ayuda para la síntesis de péptidos moderna, porque el poder de resolución de esta técnica facilita la eliminación de muchos de los subproductos sistemáticos de bajo nivel que se acumulan durante el ensamblaje de la cadena y el clivaje. La purificación de péptidos se logra más comúnmente mediante HPLC de fase inversa (RP-HPLC, UNIT 11.6 ). Alternativamente o en conjunto con RP-HPLC, se puede usar HPLC de intercambio iónico ( UNIT 8.2 ) y HPLC de filtración en gel ( UNIT 8.3 ) para el aislamiento de los productos peptídicos deseados. El progreso de la purificación de péptidos se puede controlar rápidamente mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción / ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS, UNIT 16.2 y 16.3 ) o electronebulización con trampa de iones ( UNIT 16.8 ).

La homogeneidad de los materiales sintéticos debe verificarse mediante al menos dos técnicas cromatográficas o electroforéticas, por ejemplo, RP-HPLC ( UNIT 11.6 ), HPLC de intercambio iónico ( UNIT 8.2 ) y electroforesis de zona capilar ( UNIT 10.9 ). Además, la determinación de un ion molecular por MS (ver Capítulo 16) usando un método de ionización suave es importante para la prueba de la estructura. Los péptidos sintéticos se deben controlar rutinariamente para la composición de aminoácidos adecuada y, en algunos casos, los datos de secuenciación son útiles. Los estudios de PSRC (ver discusión sobre Desarrollo de la Metodología de Síntesis de Péptidos en Fase Sólida) han permitido una comparación lado a lado de una variedad de técnicas analíticas. La mejor caracterización eficiente de péptidos sintéticos se obtiene mediante una combinación de RP-HPLC y MS, con secuenciación por análisis de secuencia de degradación de Edman o MS en tándem ( UNIT 16.1 ) para identificar las posiciones de modificaciones y deleciones. La caracterización adecuada de péptidos por múltiples técnicas es esencial.

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