Piense para qué es exactamente lo que desea utilizar para los imprimadores, diseñe con cuidado y vuelva a verificar su trabajo (o si aún no está seguro, solicite a alguien que lo revise dos veces).
Considere el contexto: dada su plantilla, ¿su imprimador podrá enlazarse en lugares distintos al sitio deseado?
Intente, si es posible, incluir al menos un G o C en o cerca del extremo 3 ‘(el par de base G / C es más estable, y esto puede ayudar en la unión específica del cebador).
Considere usar un programa de análisis computarizado para verificar sus cebadores para estructuras secundarias estables, dimerización, etc. Página en idtdna.com – IDT tiene un recurso bastante bueno en línea para estos.
Si usa estos cebadores para PCR, intente asegurarse de que sus Tm estén relativamente cerca uno del otro, dentro de 3 o 5 grados.
Si utiliza estos cebadores para la PCR con la intención de digerir el producto de la PCR y usarlo para la clonación, tenga en cuenta que muchas enzimas de restricción no cortan secuencias cerca del final de un fragmento; puede que tenga que agregar algunas bases adicionales a la 5 ‘fin de tu primer. Aquí hay un buen recurso para observar la eficacia de varias enzimas: escisión cerca del final de los fragmentos de ADN
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¿Cómo evitan las bacterias la degradación de cantidades excesivas de ADN con el complejo recBCD?
Intenta, intenta de nuevo. La síntesis de oligonucleótidos es cada vez más barata. Si su primer intento de diseñar cebadores no funciona, pruebe las condiciones de optimización (los PCR de gradiente son una cosa hermosa), pero también considere pedir oligos nuevos.
Las cosas como la clonación y el diseño de cebadores son casi más un arte o una ciencia: todos desarrollan sus propios pequeños caprichos y usan “lo que funciona mejor para ellos”. ¡No tengas miedo de experimentar hasta que lo hayas resuelto!
