Nada es simple ¿verdad? Bueno, la premisa de la pregunta no es exactamente correcta, por lo que responderla es una historia aún más complicada …
En la ciencia, los protocolos que funcionan se usan una y otra vez, pero con el tiempo las personas nuevas no saben por qué las cosas se configuraron para empezar. A veces los conceptos erróneos se infiltran y no se corrigen porque el protocolo funciona ininterrumpidamente. Mi ejemplo favorito es la generación de técnicos, estudiantes y sus mentores que incorrectamente y derrochadamente inactivan el bovino fetal (FBS) para algunos cultivos celulares. Por qué es un error muy caro e innecesario es otra discusión, pero la conclusión es que el protocolo funciona de todos modos, por lo que el error y el concepto erróneo no se corrigen y continúa propagándose.
En cuanto a la transformación de la levadura, en realidad, el ADN monocatenario no es más eficiente que el ADN bicatenario. Esto fue comparado directamente en la década de 1980 por Hieda y Keszenman. Repito, estos autores demostraron que el ADN vector monocatenario no se transformó tan eficazmente como el ADN vector bicatenario (en el método de esferoplastos) . Piénselo un momento … cuando las transformaciones se realizan con plásmidos, ¿cuál es la forma más común de ADN plásmido? La respuesta es que los plásmidos son normalmente bicatenarios. De hecho, otras metodologías de transformación (p. Ej., Electroporación) usan plásmidos bicatenarios regulares, entonces ¿por qué el método de esferoplastos debería ser diferente? (No lo es)
Cuando se usa un protocolo estándar de transformación de esferoplastos, ¿qué hay dentro? Acetato de litio, PEG, ADNmc, ADN plasmídico (que contiene el gen de interés). Aquí es donde se asoma la idea errónea: se agrega DNA CARRIER , y es el ADN del portador el que generalmente es de cadena simple (ssDNA). ¿Por qué? Los primeros protocolos no añadían ADN portador, solo las enzimas disolvían la pared celular de la levadura, el acetato de litio perforaba agujeros en la membrana celular ahora desnuda (otros cationes divalentes no fisiológicos también funcionan, por ejemplo, cloruro de rubidio, etc. .), PEG para disminuir el problema del ADN electrostático que no se mezcla bien con el citoplasma, y el vector plasmídico que contiene su gen. Esos tipos encontraron que el ADN introducido fue (1.) atacado por nucleasas presentes en la célula de levadura y (2.) el ADN adherido a los carbohidratos expuestos por toda la pared celular masticada y la membrana celular expuesta. La eficiencia era baja porque el ADN introducido estaba siendo secuestrado. Entonces, al agregar toneladas de ADN “transportador” irrelevante a la mezcla, se resolvieron esos problemas mediante acción masiva, dejando más ADN del vector plásmido útil para hacer la transformación.
Los primeros protocolos que agregaban este paso usaban ssDNA o dsDNA como portador … ambos funcionaron. Protocolos relacionados usaron ADN de esperma de salmón cortado, también abreviado ADNss !!! Por que el salmón? Quién sabe, pero casi con certeza es algo tan trivial como resultó ser lo más fácil de usar en el laboratorio justo en ese momento cuando alguien lo usó, funcionó, lo usaron de nuevo, el protocolo se distribuyó, y ahora todo el mundo estaba usando ssDNA – ¡Espera! … ¿me estaba refiriendo al ADN de esperma de salmón o al ADN monocatenario? Esta es la forma en que se transmiten los protocolos en el mundo real del laboratorio de trabajo.
En realidad, creo que el ADN monocatenario (ADNss) se comparó con el ADN bicatenario (ADNds) cabeza a cabeza en algún momento y podría haber tenido una ventaja pequeña pero cuantificable. Este hallazgo menor puede estar contribuyendo a la idea inexacta de la pregunta original. Eso es todo muy bonito, pero vuelve al punto sobre los vectores plasmídicos bicatenarios, ahí es donde está la acción real.
¿Podría ser posible “revertir” o “pacificar” la celda HeLa, es decir, volverla a una celda “normal”?
¿Cómo funciona MutS ‘escanea’ el ADN en su estado inactivado sin el uso de ATP?
La pregunta que originalmente se hizo fue mezclar manzanas y naranjas. Pero no es tu culpa … estos detalles muy, muy pequeños se malinterpretan fácilmente, se infiltran y se propagan. ¿Vas a seguir un protocolo que te haga pasar por el problema adicional de obtener un plásmido monocatenario? Ve por ello, pero no porque sea más eficiente.
Ahora conoces toda la historia. Cuéntele a todos sus conocidos, incluso a sus supervisores, y a las personas en las fiestas que lo están molestando y que desea que se vayan. Y luego, pídales a sus mentores que le expliquen por qué se hace FBS inactivador de calor a pesar de que es un desecho completamente innecesario y costoso; está en el protocolo, por lo que tiene que haber una buena razón, ¿no?
