En Western blot, ¿podemos agregar dos anticuerpos primarios a la vez?

Sí tu puedes. Está bien, en particular con los anticuerpos monoclonales madurados por afinidad, porque la especificidad hace que sea poco probable que tenga un enlace inespecífico, siempre que sus pasos de lavado, bloqueo, transferencia de electrotransferencia y protocolo general estén bien diseñados. Además, puede usar los mismos o diferentes anticuerpos secundarios para que las diferentes proteínas reconozcan las primarias. Por ejemplo, si quería detectar B-Actin y GAPDH, mezcle los anticuerpos primarios, incube durante un tiempo apropiado (suponiendo que ya haya bloqueado con 5% de BSA o leche en polvo). Luego, agrega el anticuerpo secundario, generalmente después de lavar con PBST u otro tampón común. El principal para GAPDH podría ser IgG anti-ratón, mientras que el primario para B-Actin podría ser IgG anti-conejo. Entonces debes usar el secundario correspondiente, de lo contrario no puedes detectar tu proteína.