Realmente depende de la vía, pero a veces es fácil si observamos el genoma para ver lo que parece un operón, un grupo de genes que se expresan todos juntos (común para los procariotas). El solo hecho de saber la secuencia de la enzima puede dar pistas basadas en las enzimas relacionadas y sus funciones (es decir, si es una cisteinil aspartasa, una deshidrogenasa o metiltransferasa). Eso se puede hacer fácilmente usando una búsqueda BLAST (búsqueda de alineación de todas las secuencias de proteínas conocidas).
A continuación, puede probar algún experimento de captura donde sintetice un análogo químico que sea el sustrato (o posible producto) de una enzima desconocida. Estos análogos podrían ser inhibidores irreversibles (en cuyo caso podría obtener una estructura de rayos X “cocrystal”), o tener etiquetas fluorescentes, o alguna otra cosa que pudiera controlarse.
Además, podría hacer un escaneo de alanina, donde los aminoácidos específicos en la secuencia de la enzima se mutan a alanina (que no puede hacer ninguna catálisis por sí misma) para identificar si están influyendo en la ruta.