Si tiene un anticuerpo o un aptámero específico para el antígeno, le recomiendo que configure algo así como el siguiente procedimiento:
1. Etiquete radiológicamente su aptámero o anticuerpo con gamma-ATP (que tiene P32). Si no quiere hacer eso con un anticuerpo, prepárese para hacer algunos ELIZA. Iré a través de la versión etiquetada por radio, pero al final deberías ver cómo esencialmente puedes hacer exactamente el mismo experimento con ELIZA.
2. Determine la concentración de la solución de su celda (OD 650) y haga diluciones en serie hasta que tenga una solución bastante diluida.
3. Establezca una serie de reacciones entre su anticuerpo / aptámero ( a partir de ahora los llamaré ligandos) y las células. La solución celular debe ser con concentración celular constante e incrementar la concentración del ligando.
Probablemente desee comenzar con una relación de ligando a concentración celular de 100: 1 y llegar a 10000: 1. Por supuesto, tendrá que hacer esto varias veces y cada experimento sucesivo le dirá en qué dirección debe ir.
Para un aptámero de ARN que se une a una superficie de células procariotas, es posible que desee imitar las condiciones fisiológicas con un tampón HKAM-7 a pH 7,5 incubado a 37 ° C durante 30 minutos, pero las condiciones de unión óptimas dependerán del ligando. De cualquier manera, no importa demasiado, porque a medida que aumenta la presencia del ligando, eventualmente ocuparás todos los sitios de enlace disponibles en cada celda.
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4. Filtra las soluciones de reacción a través de filtros de 0,2 micras. Esto permitirá que los ligandos no unidos se deslicen y retendrán los complejos célula: ligando. Asegúrate de hacer controles positivos y negativos. Estos serán filtros que pondrás en el ligando y no se filtrarán para determinar cuánta radiactividad está presente en total , y en la que solo pones el ligando y el filtro, para determinar cuánto ligando queda atascado allí, independientemente de las células que estén presentes. Este es tu fondo.
5. Exponer los filtros a una pantalla de phosphorimaging. El tiempo que los exponga dependerá de la radioactividad de sus muestras, que debe controlar con un contador Geiger.
6. Escanee la pantalla con un densitómetro.
Ahora tendrá una fila de datos de densidad versus concentración de ligando. A partir de esto, puede determinar cuántos ligandos se han unido a cada célula en cada concentración de ligando. Si su curva se ve lineal, entonces no ha alcanzado la saturación. Continúe aumentando la relación ligando: célula en las muestras hasta que su curva sea plana. Esa es la cantidad de antígenos que están presentes en la superficie de las células.
Nota: hay algunos detalles de este experimento que dejé para abreviar. Primero, es necesario que tengas una mezcla de ligando radiomarcado y ligando frío en tu mezcla de reacción. P32 está caliente. Sin embargo, no afecta los resultados.
Además, en un experimento en el que está cambiando la concentración del ligando radiomarcado, está cambiando la radioactividad sin procesar de esa muestra. Esto podría conducir a una gran disparidad de señal en su phosphorimager, y puede saturarlo fácilmente en un extremo mientras está por debajo del límite de detección en el otro. Por esa razón, debe reducir la relación de calor: frío de cada concentración creciente por ese aumento. Esto puede sonar confuso, así que si necesita más detalles solo pregunte.
