Las funciones arquitectónicas? ¿Te refieres al andamiaje de grandes complejos proteicos? Porque cuando dices estabilidad de proteínas, eso no es algo que observas con pulldowns, ahí observas las interacciones entre las proteínas .
Así que lo siento si estoy malentendido, pero creo que estás obteniendo algunas cosas diferentes aquí, tal vez mezclándolas un poco. O tal vez solo estoy malentendiendo.
La función arquitectónica de “una proteína” (singular) podría ser diferente de la función de un conjunto completo de diferentes proteínas trabajando juntas. Podría ser que una proteína es todo lo que se necesita, pero no creo que sea común. Las histonas son proteínas involucradas en la arquitectura de los cromosomas. Pero hay muchos, e individualmente, no pueden hacer nada. Y lo mismo puede decirse de muchos otros complejos, cada uno de los que se me ocurre (aunque las “diferentes” proteínas involucradas podrían ser muchas copias del mismo tipo, por ejemplo, actina).
Así que determinar el rol en la arquitectura de un componente subcelular específico es una cosa. En cuanto a la estabilidad de las proteínas (individuales) es algo completamente diferente. Tienes que pensar en la estabilidad ‘contra’ qué? A menudo esto sería calor. Pero también podría ser la tensión mecánica, la salazón, de un montón de cosas diferentes que pueden afectar a la “arquitectura” (estructura secundaria / terciaria) de la proteína. Para determinar esto, a menudo se observa la estructura por espectroscopía (p. Ej., Dicroísmo circular o espectroscopia de fluorescencia), mientras se aplica más y más de lo que se prueba (p. Ej., Calor).
Lo que sigue está lejos de ser una lista exhaustiva de enfoques diferentes, pero da un ejemplo o dos.
Si hablamos de complejos más grandes de varias proteínas, simplemente hacer un co-IP no necesariamente le dice nada sobre las propiedades “arquitectónicas” de ninguna de las proteínas. Si usted sabe que la proteína contra la que tiene un anticuerpo está involucrada en la estructura, puede sugerir aquellas que también puede usar como co-IP. Pero eso de ninguna manera es cierto. Al tirar de la actina probablemente co-IP un montón de proteínas motoras. Pero ellos no están involucrados en la estructura. Simplemente se asocian y usan esa estructura para sus propios fines.
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Lo que puedes hacer es encontrar una forma de observar si la estructura está intacta. Dependiendo de la estructura, esto se haría de diferentes maneras. Pero digamos la estructura de todas las proteínas involucradas en la creación de filopodia. Podrías noquear tu gen de interés, y mirar tu microscopio para ver si eso interrumpe la formación de la arquitectura. Por supuesto, no puede decir con certeza si su proteína está directamente involucrada, podría ser un factor de transcripción necesario para expresar una proteína que está involucrada. Entonces necesita hacer los controles correctos para aumentar su certeza. Lo que son también dependerá de qué proteínas / células / etc exactas. Estamos tratando con.
Puede manchar (anticuerpos, conjugados con fluoróforos) y observar la arquitectura directamente con un microscopio de fluorescencia. Aunque es posible que necesite al menos un confocal, tal vez incluso STORM u otra superresolución, según la estructura de interés. (recuerde hacer un knockout, y manchar eso también, de lo contrario no sabrá si su anticuerpo es específico en su configuración). Tienes algunas buenas imágenes de libros de texto de esa (tinción de actina, tubulina y cromatina en la imagen de abajo, tres cosas que están estructuradas debido a las proteínas, imaginé con un microscopio confocal, sospecho):
Al eliminar una proteína (¡no la que te estás manchando!) Y volver a teñir, puedes obtener una pista sobre si esa proteína es importante para la estructura. Esto es similar al experimento de philopodia anterior; no puede decir con certeza si está directamente involucrado, pero puede obtener una pista. Una vez que obtienes esa pista, prueba manchar contra esa nueva proteína y busca la estructura.
Si está hablando de una estructura más parecida a las interacciones con proteínas, como podría sugerir el punto de IP compartido, entonces podría ejecutar PÁGINA azul nativa para obtener sus complejos de proteínas. Bueno, para aumentar la probabilidad de mantener juntas las proteínas complejas (solo hacer un co-IP podría interrumpir las interacciones, dependiendo de qué, exactamente terminas haciendo, de forma experimental).
