¿Se puede usar CRISPR terapéuticamente en humanos?

Sí, pero hay algunos desafíos, como lo expliqué en una respuesta anterior sobre el uso de CRISPR como terapia rejuvenecedora en Quora, pero profundizaré más utilizando material de un blog que escribí para Desktop Genetics. Básicamente, es un ejemplo de cómo CRISPR ya se está utilizando para candidatos a terapia, lo que también demuestra por qué la secuenciación del genoma completo va de la mano cuando se trata de crear una estrategia de medicina de precisión viable para el campo.

La publicación original está disponible aquí (y también tiene algunas actualizaciones).

El “CRISPR personalizado” es una frase general que utilizamos para tratar dos escenarios donde los investigadores aprovechan la tecnología de secuenciación de ADN junto con la edición del genoma:

1. Realizar la secuenciación del genoma completo (WGS) de una línea celular específica con el fin de diseñar un enfoque CRISPR personalizado que represente las mutaciones y el genoma únicos de una célula.
2. Secuenciar células de pacientes para diseñar sgRNAs altamente específicos para terapias que modifican las células de una manera clínicamente relevante sin introducir efectos fuera del objetivo.

Estos dos escenarios son similares desde una perspectiva técnica. Ambos requieren las mismas herramientas de software y hardware, una buena informática de diseño de guías y el equipo de secuenciación correcto, así como una cartera bioinformática CRISPR que crea un conjunto ideal de guías para un objetivo específico en un caso de uso específico (por ejemplo, una célula de paciente enferma o línea celular en un laboratorio). Es primordial encontrar guías que reduzcan el objetivo mientras evitan los impactos no deseables fuera del objetivo; su ubicación o naturaleza variará en función de la célula y su genoma, que siempre tiene un grado de divergencia con respecto al genoma de referencia.

Esta personalización, o adaptación, de CRISPR no solo es útil para los ~ 50,000 científicos que utilizan CRISPR hoy en día en I + D (donde una mayor precisión ahorra tiempo y dinero y proporciona una gran ventaja a la precisión científica), sino también para los médicos que algún día podrían usarlo para tratar a los 380 millones de pacientes con enfermedades genéticas o virales raras.

Ayer, un equipo de la Universidad de Temple en Ciencias publicó un interesante estudio preclínico. Demostraron una prueba de concepto importante de que una célula T CD4 + humana con un genoma de VIH integrado puede ser dirigida con uno o dos sgRNAs para eliminar completamente el genoma viral de las células hospedadoras, sin casi hablar de efectos fuera del objetivo (Kaminsky et al. 2016). Este es un trabajo alucinante que hemos estado esperando con aliento cebado. Representa una nueva vía terapéutica para curar una pandemia que ha afectado a 79 millones de pacientes desde 1981.

También es el primer documento (que sepamos) que utiliza específicamente la frase “CRISPR personalizados”. Reconocemos que varios documentos han discutido el uso de CRISPR en el desarrollo de terapias personalizadas (ver a continuación), pero este artículo presenta el término CRISPR personalizado debido a un requisito para que los diferentes sgRNAs se diseñen para dirigirse a cualquiera de los nueve distintos Subtipos de VIH o numerosas cepas variantes recombinantes de las que se deriva el virus integrado.

Aunque el equipo de Temple se centró en una cuasiespecie específica del VIH-1, el método que utilizaron para construir su modelo de datos y eliminar las células T CD4 + del VIH in vitro probablemente sea representativo de cómo esto también podría hacerse en los pacientes. Específicamente, utilizaron la secuenciación del genoma completo para verificar la ubicación del ADN proviral integrado, que no solo les informó (y en el futuro, un investigador o clínico) sobre qué tipo de cepa del VIH estaban tratando, sino que también les proporcionó el conjunto de datos necesarios para ejecutar un análisis completo fuera del objetivo. Este riguroso interrogatorio es único porque considera el genoma único del paciente (o en este caso, la línea celular).

Además de servir como un estándar de oro de diagnóstico, el análisis WGS también sirvió como el paso más importante para garantizar que se eviten los efectos fuera de objetivo, y que el sistema CRISPR / Cas9 solo se dirigió al genoma viral. También le permitió al equipo diseñar guías dirigidas a la cepa específica del VIH. Para pacientes coinfectados (o superinfectados) con más de un tipo de VIH, presumiblemente las guías podrían diseñarse contra múltiples cepas.

Sin embargo, cuando hablamos de prácticas contemporáneas de CRISPR, sabemos por nuestras propias conversaciones con los usuarios de la plataforma DESKGEN y nuestros clientes que la gran mayoría de los investigadores tiende a utilizar el genoma de referencia como base de su búsqueda no objetivo, no el genoma específico de la línea celular con la que están trabajando. Aunque esto todavía obtiene resultados, de ninguna manera es suficiente para la confianza clínica o científica y los riesgos confunden el análisis fuera del objetivo. Un WGS antes de seleccionar guías es el ideal. De hecho, los autores comentan sobre el “análisis integral” que se realiza a un nivel de detalle sin precedentes, mediante la secuenciación del genoma completo “.

Para su crédito, los efectos fuera del objetivo de CRISPR fueron inexistentes o mínimos dependiendo de los criterios de análisis. Ninguno de los indeles detectados en las células con el genoma del VIH-1 escindido se encontraba dentro de los 60 pb de cualquiera de los sitios previstos fuera del objetivo, según lo predicho por los criterios de búsqueda que permiten hasta siete desajustes. No obstante, al expandir la búsqueda a sitios fuera del objetivo dentro de 600 o 1200 pb, se identificaron sitios relativamente extraños fuera del objetivo, incluidos varios desajustes y longitudes alineadas en todo el genoma. Después de establecer la restricción en una coincidencia perfecta con la secuencia de semilla de 12 pb más el motivo NRG PAM, ninguno de los indels cayó dentro del área de búsqueda de 60-1200 pb de un sitio fuera del objetivo previsto. Tenga en cuenta que esto no tiene en cuenta las visitas fuera del objetivo fuera de ese rango de búsqueda; esto es algo que nos gustaría ver explorado con más detalle.

Una pregunta que los médicos tendrán que hacerse será si estos toques mínimos fuera del objetivo pueden ser tolerados en los pacientes (es decir, si es “lo suficientemente seguro”). Observamos que el equipo usó hSpCas9, por lo que hay mucho espacio para optimizar la técnica al cambiar el ortólogo Cas9 por uno con menos efectos fuera del objetivo, como el eSpCas9 (Slaymaker et al., 2015) o el SpCas9-HF1 (Kleinstiver). et al. 2016). Sin duda, la presencia de objetivos no seleccionados, independientemente de los criterios utilizados, sugiere que hay más trabajo por hacer para crear un tratamiento categóricamente seguro que pueda usarse de manera confiable tanto en pacientes como en líneas celulares.

Mientras tanto, el resultado más importante de este documento es una demostración de la extirpación completa del genoma proviral del VIH utilizando solo dos sgRNA dirigidos a dos sitios. Este es un trabajo increíble.

Nos gusta pensar en CRISPR como un láser quirúrgico nanoscópico, un instrumento preciso que engaña a la maquinaria de reparación de una célula para encontrar y modificar un elemento funcional del ADN de alguna manera. Diseñar la estrategia de corte utilizando una secuencia de genoma completo de la célula le permite considerar cada variación única para garantizar un corte de ADN preciso. El equipo de Temple ha hecho un excelente trabajo y estamos encantados de trabajar en un campo en el que se realizan tantos logros emocionantes todos los días.

Si desea ayuda para diseñar una estrategia de edición del genoma específica de la línea celular o “personalizada CRISPR”, póngase en contacto y podemos hacerlo realidad.

NUEVA LECTURA SOBRE CRISPR PERSONALIZADO

1. Información suplementaria del estudio de Temple University
2. Medicina de precisión: reparación genética de la retinitis pigmentosa en células madre derivadas de pacientes
3. Edición de genoma mediado por CRISPR / Cas para tratar el cáncer de pulmón mutante EGFR: una terapia quirúrgica molecular personalizada

FUENTES

Bassuk AG, Zheng A, Li Y, Tsang SH, Mahajan VB. Medicina de precisión: reparación genética de la retinitis pigmentosa en células madre derivadas de pacientes. Sci Rep. 2016 27 de enero; 6: 19969. doi: 10.1038 / srep19969. PubMed PMID: 26814166; PubMed Central PMCID: PMC4728485.

Kaminski R, Chen Y, Fischer T, Tedaldi E, Napoli A, Zhang Y, Karn J, Hu W, Khalili K. Eliminación de genomas de VIH-1 de células T-linfoides humanas por CRISPR / Cas9 Gene Editing. Sci Rep. 2016 Mar 4; 6: 22555. doi: 10.1038 / srep22555. PubMed PMID: 26939770; PubMed Central PMCID: PMC4778041.

Kleinstiver BP, Pattanayak V, Prew MS, Tsai SQ, Nguyen NT, Zheng Z, Joung JK. Nucleasas de CRISPR-Cas9 de alta fidelidad sin efectos detectables del objetivo fuera del objetivo del genoma. Naturaleza. 2016 28 de enero; 529 (7587): 490-5. doi: 10.1038 / nature16526. Epub 2016 Ene 6. PubMed PMID: 26735016; PubMed Central PMCID: PMC4851738.

Slaymaker IM, Gao L, Zetsche B, Scott DA, Yan WX, Zhang F. Racionalmente modificados con nucleas Cas9 con especificidad mejorada. Ciencia. 2016 1 de enero; 351 (6268): 84-8. doi: 10.1126 / science.aad5227. Epub 2015 1 de diciembre. PubMed PMID: 26628643; PubMed Central PMCID: PMC4714946.

Smith DM, Richman DD, Little SJ. Sobreinfección por VIH. J Infect Dis. 2005 1 de agosto; 192 (3): 438-44. Epub 2005 30 de junio. Revisión. PubMed PMID: 15995957.

Tang H, Shrager JB. Edición de genoma mediado por CRISPR / Cas para tratar el cáncer de pulmón mutante EGFR: una terapia quirúrgica molecular personalizada. EMBO Mol Med. 2016 8 de enero; 8 (2): 83-5. doi: 10.15252 / emmm.201506006. PubMed PMID: 26747090; PubMed Central PMCID: PMC4734839.

Wang G, Zhao N, Berkhout B, Das AT. CRISPR-Cas9 puede inhibir la replicación de VIH-1, pero la reparación de NHEJ facilita el escape de virus. Mol Ther. 2016 Mar; 24 (3): 522-6. doi: 10.1038 / mt.2016.24. Epub 2016 22 de enero. PubMed PMID: 26796669; PubMed Central PMCID: PMC4786927.

Foto: CDC / C. Goldsmith, P. Feorino, EL Palmer, WR McManus || Dominio publico