La elección del anticuerpo es una de las decisiones más importantes que toma un investigador en su investigación. Nunca debe tomarse a la ligera y, sin embargo, ha sido por demasiado tiempo. Y es por eso que es una de las principales razones de la actual crisis de reproducibilidad en la ciencia biomédica (1).
¿No una, ni dos, sino tres manchas de inmunofluorescencia? Bastante complicado. Necesitará un tablero de control para validar cada una de las manchas dentro del panel, especialmente si las tres manchas involucran anticuerpos secundarios. Los controles se vuelven aún más necesarios debido a la posibilidad mucho mayor de generar artefactos con una triple mancha. También es necesario tener en cuenta otras variables: especie de muestra, cultivos / tejidos en suspensión, fresco / fijo, antígenos diana abundantes / dispersos, anticuerpos primarios monoclonales / policlonales. Supongo que el conejo de tu anticuerpo primario pero el conejo, ¿qué? IgM? IgG?
También estaría haciendo algunas preguntas de sí / no:
- ¿Estoy eligiendo productos a los que se hace referencia en publicaciones revisadas por pares?
- ¿Los anticuerpos han sido validados independientemente para inmunofluorescencia?
- ¿Se reportan reactividades cruzadas?
- ¿Se han minimizado / mitigado las reacciones cruzadas por absorción?
- ¿La conjugación de fluoróforos afecta la unión de anticuerpos a su antígeno? En caso afirmativo, ¿cuál es un fluoróforo adecuado para este anticuerpo para inmunofluorescencia?
Anticuerpos-en línea sería un lugar que utilizaría para seleccionar entre las opciones. Anticuerpos primarios | anticuerpos-online.com
Entonces, por ejemplo, si buscas anticuerpos en línea para CY3 conjugado burro anti-conejo, no aparece ni un solo producto y si buscas Cy3 conjugado de cabra anti-conejo, aparecen siete productos, ninguno de los cuales se informa a ser validado independientemente para la inmunofluorescencia, y solo uno de los cuales está asociado con 6 publicaciones citadas en PubMed.
Una vez que obtuve una lista preliminar de posibles candidatos de anticuerpos que planeaba usar, los analizaría con recursos de anticuerpos adicionales para obtener la mayor cantidad de información posible sobre ellos. Esto me ayudaría aún más a descartar reactivos dudosos. Esos otros recursos de anticuerpos:
Enciclopedia de anticuerpos : explore Antibodypedia
Identidades universales para anticuerpos : Registro de anticuerpos
Reseñas independientes de anticuerpos : pAbmAbs anticuerpo blog y sitio de revisión
¿Cómo difieren los anticuerpos Western blot y ELISA?
¿Qué es una pantalla de anticuerpos atípicos? ¿Cómo se usa?
¿Puede un análisis de sangre de inmunoglobulina detectar el nivel de anticuerpos contra la rabia?
Creo que debería consultar a un experto para obtener una guía paso a paso, y no puedo pensar en alguien mejor calificado que David L. Rimm en el Departamento de Patología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Yale, New Haven, Connecticut, EE. UU. Ha desarrollado el siguiente diagrama de flujo de múltiples pasos para la validación apropiada de anticuerpos para IHC (ImmunoHistoChemistry) y QIF (Quantitative ImmunoFluorescence) (2). Todos sus consejos no son eminentemente prácticos. Por ejemplo, es improbable que la eliminación de los antígenos diana utilizando ARNip para validar todos y cada uno de los objetivos sea la taza de té de cada investigador. Demasiado caro y consume mucho tiempo. Sin embargo, el suyo es un cuadro de toma de decisiones muy útil que mejorará la validez de los datos que genere. También puede enviarle un correo electrónico directamente ([email protected]) para obtener asesoramiento.
ELISA y la citometría de flujo son más mi fuerte pero podré dar consejos sobre las mejores prácticas. Si necesita más ayuda, solo envíeme un mensaje directamente.
No puedo insistir lo suficiente como para leer ambas referencias en su totalidad .
Bibliografía
- Baker, M. “Crisis de reproducibilidad: culpe a los anticuerpos”. Nature 521.7552 (2015): 274. Página en nature.com
- Burdeos, Jennifer, y col. “Validación de anticuerpos”. Biotechniques 48.3 (2010): 197. Página en biotechniques.com
Gracias por su A2A, Apoorva Baluapuri.
