Configuración de una celda optimizada para la expresión de una proteína específica
El operón lac es uno de los sistemas más utilizados para crear proteínas recombinantes en E. coli que luego puede purificarse y estudiarse en otros experimentos. Por lo general, su gen de interés se inserta en un vector comercial (los vectores pET son comunes) que contiene:
- Un gen que codifica resistencia a antibióticos
- El gen lacI del operón lac que codifica el represor lac (LacI)
- Su gen de interés se inserta justo después de la secuencia de ADN del promotor T7, la secuencia de ADN del operador lac y el sitio de unión al ribosoma (al comienzo del futuro transcrito de ARNm).
El vector es un plásmido corto y circular (pET-28a es 5369 pb) que es absorbido por E. coli y complementa, pero no reemplaza, su genoma existente. Cuando una célula de E. coli se divide, produce nuevas copias de su propio cromosoma “anfitrión” grande (4.6 millones de pb) que codifica todas las proteínas requeridas para que E. coli funcione, así como nuevas copias del vector de clonación más pequeño que agregaste tu gen de interés para que cada célula hija tenga ambas.
Para evitar la expresión permeable de su gen, los vectores comerciales usan un promotor T7 que solo combina con la ARN polimerasa del bacteriófago T7. La ARN polimerasa de E. coli que transcribe ARNm para producir todas las proteínas necesarias para E. coli no puede reconocer al promotor frente a su gen. El represor lac (LacI) se une de una manera específica de secuencia al surco principal de la secuencia operadora y bloquea la ARN polimerasa T7 para que no se una a la secuencia promotora.
Antes de que se transcriba tu gen de interés, deben suceder dos cosas:
- El represor lac (LacI) debe caerse de la secuencia de ADN del operador frente a su gen de interés.
- La ARN polimerasa T7 debe introducirse y reconocer el promotor T7 en ausencia de represor.
Cuando se satisfacen estos dos factores, la transcripción de su gen procederá rápidamente. Si induce durante la fase de crecimiento media del registro (DO600nm entre 0.6 y 0.8), el rendimiento de su proteína se maximizará.
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Mecanismo de inducción por IPTG
El gen que codifica la ARN polimerasa de T7 en sí mismo ha sido diseñado en muchas cepas de E. coli comercialmente disponibles bajo un sistema de operón lac modificado. A menudo verá esto llamado DE3 en el nombre de la cepa de E. coli, es decir, células BL21 (DE3). En lugar de una secuencia promotora T7 frente a la secuencia operadora lac, existe una secuencia promotora lac que la ARN polimerasa de E. coli nativa es capaz de unirse. Tan pronto como la proteína represora lac (LacI) cae de la secuencia de operador lac del ADN en el cromosoma del huésped, se transcribirá y traducirá la ARN polimerasa T7. Algunas cepas de E. coli agregan un gen adicional que codifica la lisozima T7 que inactiva el promotor T7, es decir, cepas como BL21 (DE3) pLysS. Esto evita que los niveles de expresión de fondo de la ARN polimerasa T7 expresen su proteína antes de la inducción.
Imagen adaptada del manual de expresión de pET de Novagen .
La proteína represora lac (LacI) evolucionó para detectar la presencia de lactosa (un disacárido de galactosa-glucosa combinado). Tanto el cromosoma huésped como el inserto tienen copias del gen represor lac para garantizar que siempre haya suficiente proteína LacI para valorar todos los sitios del operador de ADN. En ausencia de lactosa, el represor lac se une a la secuencia del operador en el ADN y dobla el ADN en 40 grados (como se ve en la estructura cristalina PDB ID: 1EFA). [1] Esto bloquea el acceso de la ARN polimerasa de T7 al sitio del promotor y, por lo tanto, evita la transcripción con fugas de su gen antes de la inducción.
Cuando la lactosa se une a LacI, induce un cambio conformacional en la estructura de la proteína que la hace incapaz de unirse a la secuencia de ADN del operador. IPTG es un imitador estructural de la lactosa (se asemeja al azúcar de la galactosa) que también se une al represor lac e induce un cambio conformacional similar (PDB ID: 2P9H) que reduce en gran medida su afinidad por el ADN. [2] A diferencia de la lactosa, la IPTG no forma parte de ninguna vía metabólica y, por lo tanto, no se descompone ni utiliza por la célula. Esto asegura que la concentración de IPTG añadida permanece constante, por lo que es un inductor más útil del operón lac que la lactosa en sí misma.
En el diagrama de arriba, la molécula inductora (IPTG o lactosa) es el punto verde, y el punto negro más pequeño es una molécula de agua. D149 y S193 en el represor forman una red de enlaces de hidrógeno con el agua y el grupo hidroxilo O6 de un anillo de galactosa, que encaja perfectamente en el represor lac (generalmente IPTG o lactosa). Esto estabiliza una conformación del represor lac que tiene una afinidad 1000 veces menor por el ADN del operador. [2]
Una vez que el represor lac ya no puede unirse al operador, la ARN polimerasa de E. coli nativa comienza a transcribir, en grandes cantidades, el gen de la ARN polimerasa T7 diseñado en su cromosoma. Una vez que se expresa la proteína T7 ARN polimerasa, se une a la secuencia del promotor T7 corriente arriba de su gen de interés en la inserción del plásmido y transcribe su gen diana. Por lo general, dentro de una o dos horas, su proteína de interés es con mucho la proteína más común en la célula.
[1] Bell, CE & Lewis, M. Una vista más cercana de la conformación del represor Lac vinculado al operador. Nature structural biology 7, 209-14 (2000).
[2] Daber, R., Stayrook, S., Rosenberg, A. y Lewis, M. Análisis estructural del represor lac unido a efectores alostéricos. Journal of molecular biology 370, 609-19 (2007).
