Como sugiere Richard Greifzu, existen múltiples problemas asociados con casi todos los pasos de la purificación y cristalización de las proteínas de membrana.
Sistema de expresión:
Antes que nada, necesitas identificar un buen sistema de expresión para tu proteína:
- Para las proteínas bacterianas, E. coli es la elección obvia; Sin embargo, todavía hay muchas limitaciones, voy a tocar estos en un momento.
- Las proteínas eucariotas generalmente son difíciles de purificar en E. coli debido a la ausencia de procesamiento postraduccional. Para las proteínas difíciles, usualmente se prefieren las células de levadura o Drosophila sf9.
- Para las proteínas de mamífero, las líneas celulares de mamíferos tales como CHO producirían la proteína más “auténtica”; Sin embargo, estos sistemas a menudo son costosos y complejos para trabajar.
- Sin embargo, si desea ver estructuras funcionales de proteínas específicas de tejido, a veces la expresión específica de tejido en organismos modelo es un buen camino a seguir (por ejemplo: células fotorreceptoras de Drosophila explotadas para la producción de proteínas de membrana eucariotas: receptores, transportadores y canales )
Expresión:
Realmente no sé mucho sobre la expresión y la purificación en los sistemas eucarióticos , pero trataré de abordar la mayoría de los problemas que existen en E. coli.
Para la expresión de la proteína de la membrana en E. coli , antes que nada, debes decidir cómo quieres que se exprese tu proteína:
¿Qué factores determinan el área superficial accesible al disolvente (SASA) de una proteína?
- Una cosa que puedes hacer es dejar que la proteína se exprese en el citoplasma de la bacteria. Sin embargo, dado que las proteínas de membrana tienen superficies predominantemente hidrofóbicas, es probable que se agreguen juntas y formen cuerpos de inclusión en la célula. En este caso, después de la purificación, tendrías que desnaturalizar por completo y luego volver a doblar la proteína.
- Una alternativa es agregar un péptido señal a la proteína de membrana que lo dirige a la membrana interna / externa en bacterias. La proteína puede purificarse aislando las membranas.
Después de haber decidido cómo expresar su proteína, hacer todas las construcciones necesarias y comenzar sus cultivos bacterianos, necesita optimizar las condiciones de crecimiento para garantizar el máximo rendimiento de la proteína. Por lo general, la mayoría de las proteínas se expresan bajo un promotor inducible, lo que significa que no se expresan a menos que se agreguen moléculas pequeñas (como IPTG) al cultivo. Por lo tanto, para la expresión de proteínas, se deben considerar los siguientes parámetros:
- Densidad de células bacterianas : Generalmente, la expresión de proteínas debe inducirse cuando la OD600 está entre ~ 0.4-0.8, es decir, cuando las células están en fase exponencial. Sin embargo, la DO exacta varía para diferentes proteínas y debe optimizarse para cada proteína.
- Temperatura y duración: después de la inducción de la expresión, la temperatura y la duración de los cultivos también deben optimizarse para cada proteína individualmente. Las temperaturas más altas (como 30 ° C o 37 ° C) pueden dar como resultado la formación de grandes agregados de proteínas, mientras que las temperaturas más bajas impiden la expresión. De manera similar, las duraciones más largas para la expresión pueden ser tóxicas para las células, mientras que las duraciones más bajas reducen el rendimiento.
Purificación:
Algunos antecedentes primero: para una fácil purificación de las células, las proteínas pueden expresarse con una etiqueta N o C terminal que se une fuertemente con algún resto (por ejemplo, una etiqueta GST con glutatión, His-tag con níquel, etc.) . Entonces, se pueden usar glutatión o cuentas de agarosa recubiertas de níquel para aislar la proteína solubilizada. Normalmente se agrega cierta cantidad de detergente en los tampones utilizados en diversas etapas para aumentar la solubilidad de la proteína de membrana.
La purificación de proteínas de membrana es bastante complicada y requiere incluso más optimización en cada etapa. Normalmente se agrega cierta cantidad de detergente en los tampones utilizados en diversas etapas para aumentar la solubilidad de la proteína de membrana.
Purificación de cuerpos de inclusión:
- Recolección y lisis de la expresión de las células Su proteína es seguida por centrifugación, para separar las membranas y los cuerpos de inclusión (gránulos) de las proteínas citoplásmicas (sobrenadante). Después de que el sedimento se resuspende en un tampón, los componentes de la membrana deben eliminarse. El material restante se despliega completamente utilizando altas concentraciones de agentes desnaturalizantes como la urea.
- Después de la desnaturalización, las proteínas se vuelven a plegar lentamente dializando el agente desnaturalizante fuera de la solución. Este es un paso muy complicado (y odiaba hacerlo), porque no hay absolutamente ninguna garantía de que la proteína se doble correctamente. También necesita probar muchos diferentes tampones y detergentes (en diferentes concentraciones) en esta etapa para ver cuál se adapta mejor a su proteína.
Purificación de membranas:
- La purificación de las membranas es aún más complicada. Primero implica múltiples rondas de centrifugación y solubilización de gránulos para el aislamiento de la membrana.
- Las proteínas necesitan ser extraídas de la membrana lipídica, que es la etapa más crítica. El tampón y el detergente adecuados son fundamentales para la estabilidad de la proteína en solución, de lo contrario podría conducir a la inactivación y / o desnaturalización de la proteína (especialmente si es grande).
Una vez que la proteína se ha solubilizado con éxito, puede aislarse y concentrarse usando las perlas de agarosa. La etiqueta también se escinde utilizando una proteasa.
¡Ahora tu proteína está lista para la cristalización!
Cristalización:
Los cristales de proteínas pueden crecer en tan solo una hora o hasta 3 meses. Antes de comenzar los ensayos de cristalización, debe verificar si la proteína puede permanecer estable en solución durante al menos una semana. Este tristemente a menudo no es el caso con las proteínas de membrana .
A continuación, los problemas comunes enfrentados durante la cristalización de proteínas de la membrana son:
- Como mencionó Quora User, los contactos cristalinos suceden en superficies hidrofílicas que son menos en proteínas de membrana; y
- Los detergentes a menudo interfieren con la formación de cristales.
- Las concentraciones más altas de detergentes pueden provocar la separación de fases, lo que inhibirá la formación de cristales y / o dificultará la reproducción.
- Teniendo en cuenta que es tan difícil obtener cristales en absoluto, es aún más difícil obtener cristales de alta calidad (mayor resolución).
Bien, estos son todos los problemas que se me ocurren para obtener las estructuras de las proteínas de membrana por ahora (estoy seguro de que estarás de acuerdo en que son más que suficientes). Agregaré más cuando pienso en ellos.
¡Hazme saber tus pensamientos si tienes alguno!
Recursos adicionales:
- Proteínas desafiantes purificantes: principios y métodos
- Una guía peatonal para la cristalización de proteínas de membrana
- Consejos para cristalizar proteínas de membrana
