La respuesta a su pregunta casi describe qué tipo de describe lo que una gran parte de los bioquímicos / biofísicos hacen para ganarse la vida. La respuesta a su pregunta es muy amplia y trataré de cubrir algunos de los principales métodos.
El término “cambio de conformación” es muy abierto. Podría significar uno de los tres.
- Cambio de conformación global : en una proteína multidominio, los dominios completos se mueven o reorganizan. En proteínas más pequeñas, la reordenación a gran escala de los elementos de la estructura secundaria también cae bajo este soporte.
- Cambio de conformación regional : regiones pequeñas como bucles, a menudo son dinámicas y pueden cambiar su conformación. La forma y el pliegue totales de la proteína permanecen relativamente constantes, pero una pequeña porción puede moverse.
- Conformación local : en el sentido microscópico, la estructura de una proteína no está fija. Las variaciones menores siguen sucediendo. La conformación individual de la cadena principal y los elementos de la cadena lateral experimenta variaciones menores continuamente.
Dependiendo de lo que intentes estudiar, tu método variará.
Probando cambios conformacionales globales.
Cristalografía de rayos X: si el cambio se desencadena por un evento específico, como la unión de un ligando, y si los estados se pueden aislar de manera estable, este es un método que se puede probar. Es más fácil decirlo que hacerlo e implica cristalizar las proteínas y luego obtener su estructura desde allí. Este método no proporciona información cinética (se refiere a escala de tiempo).
(Ejemplo: página en sciencedirect.com)
Fluorescencia: existen muchos métodos basados en fluorescencia y el método de elección dependerá del sistema que se estudie. Un método popular de elección sería FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster). Esto implica la introducción de sondas fluorescentes ubicadas estratégicamente en cada dominio. El efecto FRET depende de la proximidad de las 2 sondas. Cuando los dominios se separan más debido al cambio de conformación, la eficiencia de FRET disminuye (hasta la sexta potencia, por lo que es bastante sensible). Con una configuración como un flujo detenido o por titulación, se puede estudiar la cinética del proceso.
(Ejemplo: http://www.pnas.org/content/102/…)
Dicroismo circular: esta es una sonda de la estructura secundaria total de la proteína (es decir, no tiene una resolución específica para sentarse). Si se produce un gran cambio en la estructura secundaria (espiral -> transición de hélice), por ejemplo, eso se puede estudiar con este método. Sin embargo, la reorganización de dominios sin cambios significativos en la estructura secundaria o con un cambio menor en la estructura secundaria neta no se puede probar con este método. Esto también es susceptible de estudios cinéticos.
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¿Cuán reproducibles son las estructuras cristalinas de rayos X de las proteínas?
Otros métodos bioquímicos : en un grupo grande, hay demasiados métodos (como movilidad en un gel de poliacrilamida nativa, tiempo de retención en una columna analítica de cromatografía de exclusión por tamaño, sensibilidad a la digestión con proteasa, tiempo de sedimentación en una ultracentrífuga analítica, masa diseñada específicamente experimentos de espectrometría) que pueden usarse para detectar grandes cambios estructurales y estos métodos son aplicables solo a sistemas adecuados.
Probando cambios conformacionales regionales y locales.
FRET y la cristalografía son útiles a veces para estudiar los cambios regionales. La flexibilidad local de las regiones proteicas también puede verse indirectamente a partir de los factores B cristalográficos. Pero la aplicación nuevamente depende del sistema que se estudia. El desafío aquí es que comiences a buscar partes cada vez más pequeñas de una proteína más grande. Esto implica obtener una resolución específica del sitio. Lo que me lleva a …
Espectroscopía de RMN : utilizo la espectroscopía de RMN regularmente en mi investigación y no puedo hacer suficiente hincapié en cuán poderosa es esta herramienta para estudiar los cambios conformacionales en las proteínas (digamos que en un proceso poco científico debía elegir un método ciegamente antes de conocer los detalles de el problema, yo elegiría este.). No incluí esto en el conjunto anterior porque si bien es definitivamente aplicable y capaz de probar grandes cambios conformacionales, su poder radica en la resolución específica del sitio que puede ofrecer. La elección del experimento de RMN depende del problema específico (HSQCs, mediciones R2, mediciones RDC, PRE, por nombrar algunos). La pobre sensibilidad del método generalmente prohíbe obtener información cinética directamente (En realidad, no hay algunos experimentos de hiperpolarización “no convencionales”). que puede darle información cinética observada directamente). Sin embargo, la escala de tiempo de ciertos procesos puede obtenerse indirectamente. Si la muestra en equilibrio intercambia entre dos estados, también se puede obtener la escala de tiempo de este proceso de intercambio (con excepciones).
(Ejemplo – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/…)
Simulaciones de Dinámica Molecular : si bien no es una observación directa de la proteína, muchos aspectos de la dinámica de la proteína actualmente no son accesibles para nosotros. La complejidad de las proteínas supera con creces el alcance de la tecnología experimental actual. La simulación in silico de proteínas proporciona una gran visión de estos procesos. Especialmente se pueden estudiar cambios en las conformaciones del rotámero en las cadenas laterales de proteínas o cambios que están en la escala de tiempo que cae en el “punto ciego” de la espectroscopía de RMN.
(Ejemplo – http://peds.oxfordjournals.org/c…)
Tenga en cuenta que posiblemente no pueda cubrir toda la gama de experimentos posibles en esta publicación (probablemente pueda intentar acercarme a eso si alguna vez decidiera escribir un libro sobre este tema). Los ejemplos aquí son solo representativos. Los obtuve dentro de los primeros cinco resultados en una búsqueda en Google utilizando palabras clave relevantes. En realidad, se están diseñando experimentos más nuevos y se están implementando experimentos existentes de manera innovadora todos los días para estudiar este interesante fenómeno.
